巴比二氏综合症家系致病基因的筛选、定位及测序

巴比二氏综合症家系致病基因的筛选、定位及测序 重庆医科大学 硕士学位论文 巴比二氏综合症家系致病基因的筛选、定位及测序 姓名:刘兵 申请学位级别:硕士 专业:临床检验诊断学 指导教师:尹一兵;杨正林 20080401 重庆医科大学硕士研究生学位论文 巴比二氏综合症家系致病基因的 筛选、定位及测序师 疋1豆及删J予 摘要 目的:对中国汉族2个ELL--氏综合症Bardet-BiedlSyndrome,BBS 遗传性疾病家系进行遗传连锁分析及基因测序,筛选鉴定新致病基因 位点和/或新致病基因及鉴定己知基因的新突变,以确认致病基因并 阐明致病机理。 方法:1.采集中国汉族2个巴Ik--氏综合症遗传性疾病家系的临床资 料和血样标本,提取血样标本中DNA,建立病人的临床信息数据库。 2.针对巴比二氏综合症遗传性疾病的己知基因, 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 引物进行测序, 排除或定位于己知基因。应用遗传连锁方法,选择己知位点及已知基 因物理位置附近的STRshorttandomrepeatmarkers标记物进行已知 基因及已知位点的筛查。3.对是己知位点和基因的家系的阳性位点附 近有连锁的,在其附近进行进一步的遗传间距更近的遗传连锁分析;对 排除己知位点及基因的家系,用382个STR标记物ABIPRISM LinkageMappingSetsV2.5一MD,PCR扩增其片段,采用ABl3100 遗传分析仪进行全基因组的扫描。4.用国际公认的遗传连锁分析方法, 根据等位基因单倍体分型结果,应用两点法,分别计算STR标记 物的LOD值LodScore值, 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明疾病基因与该位点连锁的紧密性大 小,以最大LOD值确定阳性位点。5.在阳性位点附近,根据荧光标 3 重庆医科大学硕士研究生学位论文 记的STRsinglenuc eotidepolymophism基因型检测结果,进行更 精细定位,确定疾病基因的最小遗传间距MGIMinimumGenetic Interval。在MGI内,通过候选基因法筛选其致病基因及突变。 结果:1.建立了中国汉族巴LL--氏综合症遗传性疾病家系的临床及临 床信息数据库。2.完成了对1个巴比二氏综合症Bardet.Biedl Syndrome,BBS疾病家系是己知基因BBS7的连锁定位和测序,发现 其是已知基因的新突变,为BBS致病机制的进一步阐明提供了依据。 3.完成对1个BBS遗传性疾病家系是已知基因BBS5的连锁定位,测 序工作目前正在进行中。4.本课题研究的结论,对于该领域的研究具 有重要的学术价值,为以后的基因筛查、基因诊断和基因治疗都起到 了很大的作用。 结论:1.我们收集了2个中国汉族巴比二氏综合症遗传性疾病家系的 临床资料,丰富了神经系统遗传性疾病的遗传资源信息。2.发现了中 国汉族1个己知基因BBS7的新突变。 关键词:BBS,基因,位点 4 重庆医科大学硕士研究生学位论文 MAPPINGA DIDENTIFICATIoNoFDI SAESE.CAUSINGGENESFoR Bardet-BiedlSyndrome ABSTRACT Objective:wecollectedseveralChinesefamilieswithBardet-Biedl Syndrome,andperformedlinkagenalysisandequencinganalysis,in ordertoidentifynewgenes/lociorfindnewmutationfork owngenes, andBardet-BiedlSyndrome. Methods:1.SeveralBardet-BiedlSyn romefamiliesw recollected, bloodsamplesofamilymemberswereobtained,andDNAwereextracted, theclinicaldataandsamplesdatabasewereestablished.2.Amplification forsequencinganalysisbyusingspecialprimersforknowngeneswas performedtoexcludethknowngenes,linkagea alysisforeveral microsatellitemarkerswhichtightlyencompasstheknowngenesand lociwereperformedtoexcludethknownloci.3.Iftheknowngenes andlociwereexcluded,thegenome-widescanwerep rformedforanovel locus:382STRshorttandomrepeatmarkersABIPRISMLinkage MappingSetsV2.5一MDwereamplifiedorlinkagenalysis.4.Specific softwarewasusedtocalculatethelodScorevalueLODvalue,which indicatesthpossibilityofdiseasegenelinkedtothespecificlocus. 5 重庆医科大学硕士研究生学位论文 whichbasedontheal elehaploidtypingresultwithtwo.pointme hodt definitethpositivelocibythelargestLODvalue.5.Thefluorescence STRwereusedtoperformfurtherg notypinganalysis,inordertofinda exactlinkagelocusandnarrowdowntheMGIMinimumGenetic Interval.Candidategeneapproachwasusedto identifiedthe disease?causinggeneandmutation. Results:1.Collectedc ini alandgeneticnformationoftwo Bardet-BiedlSyn rome.2pletedthesequencinganalysisfor Bardet-BiedlSyn romeknowngenes,excludedtheknowngenes, completedthegeneticl nkagenalysisforknowngenesandloci,the LODscoreofmostoftheseSTRmarkersa elessthan0when00.0, severalm rkers’LOD0,butwhenaddseveralflankmarkes,theLOD0, thenexcludedtheknowngeneSandloci.3pletedthe genome-wideSCanofSTRshorttandomrepeatmarkersforthe2 pedigrees.4.Foundseveralpositiveloci,respectivelyonth 4th chromosomefor1046,theLODscoreoftheselociareallmorethan1 when00.0,promptedthepossibilityoflinkageintheseloci.Found1 positiveloci,respectivelyonth5thchromosomefor1022,theLOD scoreoftheselociaremorethan1 when00.0,promptedthepossibilityof linkageintheseloci.5.Includedthelocion4stfor1046pleted sequencinganalysisfor2genesinpossiblelocuson4ndchromosome, andhavenfoundanewmutations,identifyingthediseasegeneforthis 6 重庆医科大学硕士研究生学位论文 familyisinprogress. Conclusion:I.Establishedclinicalandg neticinformationoftwo Bardet-BiedlSyn romefa ilies,appliednewgeneticinformationfor Bardet-BiedlSyndrome.2pletedaBard -BiedlSyn romefa ilies Bardet?BiedlSyndrome,BBSdiseaseisknownfamilyBBS7gene sequencingandpositioningfthechain,foundthenewgeneisknown mutation.3.TheotherBBSfamiliescompletionofageneticd seasegene familyknownBBS5chainpositioning,sequencingworkisinprogress.4. Theconclusionofthistudyhaveimportantacademicvalue,andhavea importantroleingenescreening,genediag osisandgenetherapthy. KeyWords:Bardet-BiedlSyndrome,gene,locus 7 重庆医科大学硕士研究生学位论文 英文缩写 A bp ? cld CDNA d ddH20 DNA dNTP EB EDl’A EP g h HD KD L mln MGI mRNA ng PCR pH 英汉缩略语名词对照 英文全称 absorbance basepair centigrade centimorgen complementary deoxyribonucleicacid day doubledistillationwater deoxyribonucleicacid Eoxyribonucleoside triphosphate ethidiumbromide ethylenediaminetetraaceticacid EpoxyResin gram hour HiDi?formamide kilodalton liter minute MininumGeneticInterval messengerribonucleicacid nanogram polymerasech inr action potentialofhydrogen 中文全称 吸光度 碱基对 摄氏度 厘摩尔根 反向转录脱氧 核糖核酸 天 双蒸水 脱氧核糖核酸 脱氧核糖核苷 酸 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 环氧树脂 克 小时 甲酰胺 千道尔顿 升 分钟 最小遗传间距 信使核糖核酸 纳克 多聚酶链反应 酸碱度 重庆医科大学硕士研究生学位论文 pmol 巾m SDS SeC SNP STR Taq TE 啊S ?l 肛mol picomole roundperminute Sodiumdodecylsulfate second Singlenucleotidepolymorohism shorttandomrepeat TaqDNApolymerase tris.ED弱buffer trishydroxymethyaminmethane microliter micromole 2 皮摩尔 转|禽 十二烷基硫酸 钠 秒钟 单核苷酸多态 性 短片段重复序 列 TaqDNA聚 合酶 TE缓冲液 三羟甲基 氨基甲烷 微升 微摩尔 重庆医科大学 研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料,与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处,本人承担一切相关责任。 学位论文作者签名:犁日期:一 ‘学位论文版权使用授权书 本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定,印:研究生在攻读学 位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学.本人保证毕业离校后,发表论 文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学。学校有权保留并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅.学校可以公布学 位论文的全部或部分内容保密内容除外,可以采用影印、缩印或其他荨裒保存 - 论文。 ? 论文作者签名: 指导教师签名: 日 重庆医科大学硕士研究生学位论文 巴比二氏综合症家系致病基因的筛选、定位及测序 .^』.-JL 刖舌 遗传病是指生殖细胞或受精卵的基因异常所引起的疾病,它常具有垂直传递 的特型11。基因是遗传的功能单位,其本质是特定的核酸序列,核酸上4种碱基 的排列顺序包含的遗传信息。基因通过转录、翻译、合成具有生物活性的蛋 白质 分子,从而完成生命活动。基因异常引起蛋白质发生改变,就有可能导致遗传病。 遗传病发生的基础是基因异常,它通过蛋白质分子表现出来。染色体是基因的载 体,所以可以从染色体、核酸和蛋白质水平上进行研究。 随着人类物质生活水平的不断改善和医疗技术水平的不断提高,很多传染性 疾病在全球范围内已经逐渐得到控制或减少其肆虐程度。而对人类健康危害很大 的疾病,如癌症、心血管疾病、脑血管疾病等在21世纪在很大程度上将被人类征 服,因此,遗传性疾病对人类健康的威胁和危害性将更加明显和突出。 遗传病也称为基因病。遗传病的研究近年来得益于分子生物学的快速发展而 取得了举世瞩目的进展。在临床各学科的遗传病中,以神经系统的遗传病的病种 最多,约占所有遗传病的60%以上。到1998年4月30日为止所收集到的孟德尔 遗传病中,神经系统遗传病为361种,其中已克隆的有195种,两者均占各科遗 传病的首位【2】表1.I。大约有33%的己知的孟德尔遗传性疾病表现有中枢神经 系统症状;已发现的遗传性代谢病约200种,其中2/3出现神经系统异常。在 国 内,有关神经系统遗传病的文献报道愈来愈多,其中最多见的疾病是肝豆状核变 性、假肥大型肌营养不良、遗传性共济失调、脊肌萎缩症、神经纤维瘤病、Down 综合症等。 遗传方式是指亲代的性状包括遗传性疾病由遗传物质基因通过配子 传递给后代的方式。基因的遗传遵循分离定律、自由组合定律、连锁和交换定律, 但性状的遗传有所不同。亲代的性状有些由单个基因所决定的,而另一些性状则 是由多基因决定的,如血压等。遗传病按受累的遗传物质分为单基因病、多基因 8 重庆医科大学硕士研究生学位论文 病、染色体病、线粒体病、体细胞遗传病。 l单基因病的遗传monogenicdisorder由染色体上单一基因的一个或两个 等位基因突变所致,基因突变可发生在一对同源染色体的其中一条染色体上,也 可发生在一对染色体的等位基因上。其严格遵循孟德尔遗传定律,临床上单基因 遗传病的病神最为多见。其遗传方式主要有:常染色体显性遗传、常染色体 隐性 遗传、X连锁显性遗传、X连锁隐性遗传、Y连锁遗传等【41。 2多基因病的遗传polygenicdisease是指多个基因座位上的基因和环境 因子共同作用产生的遗传病,又称为多因子病。多基因病中的有些一个或少数几 个基因主导作用明显,比较容易检出,这类疾病为探讨多基因病的分子基因基础 提供了重要的研究途径;另一些则是由许多微效基因作用累加引起的15】。 人类和各种生物细胞内的遗传物质有保持自身稳定的能力,这就是遗传的基 础;但稳定是相对的,并非是一成不变的,在一定内外因素影响下,遗传物质也 可以发生变化,这就是变异的基础,也是遗传性疾病的根本原因。一般将遗传物 质质或量的持久性改变称为突变mutation不包括正常基因组重组所出现的变 化。一般情况,突变专指基因突变,即碱基对的组成或排列顺序发生了改变。基 因突变具有稀有性、随机性、可逆性和突变热点等特点。基因突变的诱导因素有 物理因素,如紫外线、电离辐射;化学因素,如羟胺HA、亚硝酸盐、甲醛等; 生物因素,如病毒等;另外细胞内的某些酶也可能形成突变的诱导剂。当基因发 生有害性突变时,DNA可进行损伤修复,修复方式有光复活修复、切除修复、重 组修复。基因发生突变的类型有点突变、片段突变。其中点突变又分为碱基置换 同一突变、无义突变、错义突变、终止密码突变、插入或缺失突变:片段突变 又分为缺失、重复、重排17】。 基因突变导致疾病产生的原因: 1基因突变蛋白的形成基因突变后,可从两条途径改变这些正常蛋白的合 成,形成突变蛋白mutantprotein:一条途径是突变如错义突变、移码突变、 插入或缺失突变等改变了多肽链的氨基酸顺序蛋白质的1级结构,使蛋白质 失去J下常功能,这称为原发性损伤primaryabnormalities;另一条途径是突变并 不直接影响某一蛋白质,而是通过干扰多肽链的合成过程如参与蛋白质翻译的 各种因子的突变、翻译后修饰以及蛋白质与辅助因子的结合改变而间接地使这一 9 重庆医科大学硕士研究生学位论文 功能蛋白质结构异常2级或3级结构,从而失去J下常的生物活性,称为继发性 损害secondaryabnormalities。 2突变对蛋白质功能的影响?功能降低或丢失的突变10ssoffunction, 这是最常见的突变形式,不论是编码区域的突变为,还是调节区域的突变,多数 发生了突变的基因其蛋白质功能都会降低,甚至完全失去。最严重的情况是蛋白 质根本不能合成。?功能增加的突变gainoffunctionmutations,在少数情 况下,如调控序列的突变,也可能使蛋白质合成的数量增加,或者使其活性增强。 但活性增强同样也可导致疾病发生。?特征改变的突变novelproperty mutations,这种突变会导致突变蛋白有了新的特性,并因此导致疾病的发生。 神经系统遗传病可见于任何年龄,也可起病于任何年龄。另一方面,在同一 系统的遗传病中,其中各型的起病年龄也有所不同。不过,大多数的神经系统遗 传病均在30岁以前出现症状。神经系统遗传病的症状和体征多种多样,可分为三 部分:?普遍性症状,即很多神经遗传病均具有临床表现,如智能发育不全、抽 搐等;?特征性症状,是某些疾病的诊断依据或重要提示;?非特异性症状,如 肌无力,感觉异常等呻1。 BBS的发病机制还不是很清楚,遗传因素在发病机制中起了很大作用。目前, 随着分子生物学技术的发展,一些BBS的致病位点与相关基因已被定位、克隆、 测序、表达、调控以及进行突变分析,已知单基因遗传性偏头痛遗传连锁位点有: BBSI、BBS2、BBS3、BBS4、BBS5、BBS6、13BS7、BBS8、BBS9、BBSl0、BBSl1、 BBSl2,但仍然有25%的BBS病人没有找到确定的致病基因16?20l。如图卜l eLk,--氏综合症Bardet-BiedlSyndrome,BBS疾病的分子遗传学研究 目前仍旧是个热点,但尚有许多致病位点和相关基因未发现,国内对BBS的基 因研究工作才刚刚起步,仅有少数对已知基因新突变的报道,国外正在对BBS 的致病基因进行深入的研究,不断有新的致病基因新位点被定位和新基因被克 隆的报道,而国内的研究单位仅是通过对中国人群散发病例进行报道,检测已 知基因的新的序列改变,以探求该基因与中国人的发病机制有无相关性,尚未 有新基因克隆的报道,也未见对该致病基因功能方面的研究,为此,我们开展 了该疾病基因的基础研究。本研究针对已收集的2个BBS中国汉族家系,用对 10 重庆医科大学硕士研究生学位论文 已知的12个基因附近的STRshorttandomepeatmarkers标记物ABI PRISM@LinkageMappingS tsV2.5一MDlO,扩增其片段,采用ABl3100遗传 分析仪进行基因组扫描,从而进行遗传连锁分析乜1。在阳性位点附近再进行更 多的STR,进行基因连锁分析。通过对已知基因的筛查和排除,并采用定位克 隆和候选基因法相结合的方法,找出基因的突变位置。找到突变后,我们将开 展对BBS功能基因组的研究,筛查、识别和鉴定。下一步要进行的是对克隆的 基因进行相关功能分析,包括体外生化功能分析和建立以转基因和基因敲除动 物模型为主的体内功能分析,揭示其调控机理,从而阐明中国人BBS的发病机 制,为进一步探索有效的分子诊断和疾病防治途径奠定基础。 已知位点和基因 发现年份 发现人 种族 染色体位点 BBSl 2002 MykytynPuertoRicarl 1lq34 BBS2 2001 NishimuraBedouin 16q21 BBS3 2002 Pasqua]atoIsraeli Bedouin3p12-q13 BBS4 200l MykytynBedouin 15q22.3一q23 3BS5 2004 Li.J.B. ArabidopsiS2q31 BBS6 2000 S1avotinekAmish 20p12 BBS7 2003 Badano European 4q21 BBS8 2003 Ansley . 14q32.1 BBS9 2005 Vernon 7p14 BBSlO 2006 StoetzelTurkish 12q21.2 BBSll 2006 Chiang Hutterite 9q31一q34.1 BBSl2 2007 StoetzelEuropean 4q14-q16 图l?l:已知的BBS分子遗传学基础 Figl一1:BBSmoleculegen tics 第一部分:家系病例的采集,DNA的提取 重庆医科大学硕士研究生学位论文 在中国汉族收集汉族了2个BBS遗传性疾病家系,对先症者及其家属进行检 查及询问,了解先症者及其家属的发病情况,绘制家系图谱,分析遗传模式, 抽 取静脉血,提取DNA。 第一节家系资料 1家系资料的采集 BBS综合症家系1022:该家系来源于成都金堂县,先症者为1022001,该 家系3代,系近亲结婚,我们采集了4个家族成员的血标本,其中患者1个, 未 患病者3个。 BBS综合症家系1046:该家系来自四川邻水县,先证者为1046001,该家 系3代,系近亲结婚,家系共25人,其中患者5人3人已死亡。我们采集了 22 个标本,其中患者2个,未患病者20个。 所有的家系均由四川省人民医院神经科和眼科经验丰富的主任医师确认,诊 断。并作相关检查。 BBS的临床症状:应包括视网膜营养不良,先天性肥胖,多指趾畸形、生殖腺 发育不全、智力发育迟缓、肾异常六个主要特征。具有六大主要特征中的四 项患 者可以诊断为BBS。BBS的次要特征有肝脏纤维化、糖尿病、哮喘、内分泌 紊乱、 矮小、听力丧失,发育延迟和语言缺陷。 2血样的采集: 本研究遵循赫尔辛基宣言及及中国卫生部颁布的人类遗传病标本采集指南, 每个参与者均签署了由四川省人民医院提供的知情同意书,采用EDTA二钾 抗凝 剂抗凝,抽取静脉血,共采集10ml血标本。 3家系图谱: 12 重庆医科大学硕士研究生学位论文 口 男性 ? 系谱中常用的符号 Thenotationsf rpedigree o 女性 囹 性别不确定 不确定是否患病 ?? 患者 结婚 近亲结婚 口?o 婚外恋 单卵双生儿 13 已死亡个体 再婚 子女 双卵双生儿 警一 重庆医科大学硕士研究生学位论文 ? I? ? 图1-21022家系 Fig1-21022pedigree I丫:2 图1-2 1046家系 Figl一21040pedigree 系谱分析: 从以上系谱可以看出: 1022、1046家系是近亲结婚,其双亲为正常,兄弟中 有 正常或患病机率,根据孟德尔遗传规律,提示可能为常染色体隐性遗传方式。 因 患者的居住相对集中,居住环境基本相同,所以排除了环境因素的影响,所以 遗 传因素是这2个家系致病的主要原因。 14 重庆医科大学硕士研究生学位论文 1材料 1.1主要试剂来源 第二节DNA的提取 "Iris EDTA?Na2?H20 浓盐酸 NaOH NaCI KHC03 NH4CI 硼酸 SDS 蛋白酶K 无水乙醇 氯仿 7596乙醇 医用乙醇 琼脂糖 1.2主要试剂配制 成都科龙化工试剂厂 重庆天府精细化学品厂 成都科龙化工试剂厂 天津市化学试剂一厂 天津市瑞金特化学品有限公司 成都科龙化工试剂厂 成都科龙化工试剂厂 成都科龙化工试剂厂 美国PROMEGA公司 美国AMRESCO公司 天津市化学试剂一厂 成都金山化学试剂有限公司 天津市化学试剂一厂 重庆普惠公司 上海GENET CH公司 1配制lM"Iris.HClpH8 0,500m1. 称取Tris--羟甲基氨基甲烷75.6克,加去离子水500ml,加浓盐酸26.2ml 调pH8.0,高压灭菌后保存备用。 2配制0.5MEDTApH8.O,1000m1. 称取EDTA乙二胺四乙酸186.1克,加入800ml重蒸水中,加热至60?,再 加209NaOH完全溶解并冷却至室温后用10NNaOH将其pH调至8.0,加重蒸水 15 ,,,,,,,,,?D刁”Q? 0 Q O H?@p@p 0 0 0 0 0 0 重庆医科大学硕士研究生学位论文 至1000ml,高压灭菌后保存备用。 35MNaCI,1000ml 称取292.29NaCl于800ml重蒸水中,加重蒸水至1000ml,高压灭菌后保存 备用。 4红细胞裂解液pH8.O,1000ml: 称蔗糖109.59,lmolTns?HCI10ml,ImolMgcl25ml,Triton.10010ml,加去离 子水至1000ml,高压灭菌后保存备用。 5STE溶液,1000mh 称取5MNaCI5.89,0.5MEDTApH8.02ml,1MTfis.HClpH8.O,加去 离子水至1000ml,高压灭菌后保存备用。 6配制50xTAE电泳缓冲液,100mh 称取Tfis24.29,冰醋酸5.7ml,0.25m01/lEDTApH8.020ml,加重蒸水至 100ml, 高压灭菌后保存备用。 710%SDS溶液,1000ml 在900ml重蒸水中溶解1009电泳级SDS,加热至68?助溶,加入几滴浓盐 酸调节溶液的pH值至7.2,加重蒸水定容至1000ml,高压灭菌后保存备用。 1.3主要实验器材及来源 1 高压灭菌器 2 电子分析天平 3 低温离心机 4 平板离心机 5 涡旋振荡器 6 电泳仪 7 凝胶成像仪 8DNA浓度测量仪 9 水浴箱 10恒温金属浴 16 日本SANYO公司 梅特勒.托利多仪器上海有限公司 德国Eppendorf公司 美国Beckman公司 姜堰市康健医疗器具有限公司 成都BIO.RAD公司 成都B10.RAD公司 成都BIO.RAD公司 北京长安科学仪器厂 Femrrter公司 重庆医科大学硕士研究生学位论文 11BD采血空针 上海碧迪医疗器械有限公司 12BD真空采血管EDTA抗凝上海碧迪医疗器械有限公司 2方法 2.1DNA的提取酚一氯仿提取法 1.取5ml外周静脉血EDTA抗凝于15ml离心管中,加入2倍体积的4。C预冷 红细胞裂解液,轻轻倒转,4?静置15min。 2.2800rpm离心20min,小心倒掉上清。 3.重复步骤2,直至红细胞完全裂解。 4.加入STE溶液2ml,再加10%SDS0.2ml,PK蛋白酶K24ui,混匀。 5.37?孵育3.5h或过夜。 6.加入酚2ml或等体积,上下颠倒混匀lmin,3000转离心10min,吸取上清。 7.加入酚1.2ml和氯仿1.2ml摇匀,3000转离心10min,吸取上清。 8.加入氯仿2ml和异戊醇80ul摇匀,3000转离心10min,吸取上清。 9.加入异丙醇O.6.1:1,大约460u1反复混匀倒转10min,可见絮状沉淀, 若不见絮状DNA,将EP管11000转离心10min,弃尽上清,再用无水乙醇40ul 洗涤2次以上,弃上清,并放空气中干燥,最后再加入40ulTE100ul蒸馏水 稀释溶解DNA,置.20?保存备用。 10.DNA浓度的测定。把提取出的DNA稀释50倍,在DNA测定仪上检测DNA 的浓度及纯度用A260/A280表示,并在容器上做好标记。 3结果 3.1 1022家系 17 重庆医科大学硕士研究生学位论文 表1-1各标本DNA浓度及A260/A280比值见下表 Table?l TheconcentrationandA260/A280ofsampies’DNA 3.2 1046: 表1-2各标本DNA浓度及A260/A280比值见下表 Table1-2TheconcentrationandA260/A280ofsamples’DNA 重庆医科大学硕士研究生学位论文 第三节讨论 Bardet.Biedle综合症Bardet.Biedlesyndrom .BBS是一种常染色体隐性遗 传性疾病,主要临床表现有视网膜营养不良,先天性肥胖,多指趾畸形、生殖腺 发育不全、智力发育迟缓,。肾畸形等。约35%的患者伴有耳聋[1’5】。1866年,Laurence 和Moon描述了一个有视网膜变性、性腺发育低下、低智和痉挛性截瘫的疾病。 60年后,Bardet和Biedl分别描述了典型的Bardet.Biedle的综合症,应包括视网 膜营养不良,先天性肥胖,多指趾畸形、生殖腺发育不全、智力发育迟缓口一】。 如图所示: 后来发现90%以上的病例有。肾脏的异常,因此,肾异常也列为第六个主要特 征?】。具有六大主要特征中的四项患者可以诊断为BBS。BBS的次要特征有肝脏纤 维化、糖尿病、哮喘、内分泌紊乱、矮小、听力丧失,发育延迟和语言缺陷。BBS 是罕见的遗传病,其发病率较低1/100,000。在近亲结婚的地区明显增高, 在阿拉伯半岛和北非从事游牧的阿拉伯贝督因人群中发病率最高,中东最高 发病 率是1/13500【5】。分子遗传学研究表明本病具有遗传异质性,目前已定位 BBS致 病基因并已克隆的基因有12个,包括1lql3.2的BBSl,16q12.2的 BBS2,3q11.2 BBS3,l5q24.1BBS4,2q31.1BBS5,20p12.2BBS6,4q27BBS ,14q32.11 BBS8TTC8,7P14BBS9,12q的BBSl0,9q33.1的BBSIl,4q27的BBSl2乜?e-22]。 即便如此,也还有大约25%的患者没有找到致病基因。并且我国很少有关于 BBS 疾病的研究报道。 19 韭陡睡科大学碰士研咒生学位论文 圜l一?患者鄙分拴查结果 FigI-4ExamineResultofPatisn 重庆医科大学硕士研究生学位论文 参考文献 Il】BealesPLet al,Hydrometro?colposandpolydactyly:acommonneonatal presentationofBardet?Biedl[J].JMedGenet.1997.34:92?98 f212 MckusickVA.人类孟德尔遗传.第l1版.北京:北京医科大学中国协合医 科大 学联合出版社.1997,1940.19410zerG,YkselBU,SuleymanovaD,etal, ClinicalfesturesofBardet?Biedlsyn rome.ActaPaedi trJpn.1995,37:233-236 【3】 DavidA,BitounP,LacombeD,etal,Hydrometro?colposandpolydactyly:a commonneonatalpresentationofBardet?-Biedlan Mckusick?-Kaufman syndromes[J].JMedGenet.1999,36:599?603 【4J GreenJS,ParfreyPS,HarnettJD,FariedNR,CramerBC,JohnsonG,Health0, McManamonPJ,O’LearyE,Pryse?PhillipsWThecardinalm nifestationsat Bardet?Biedlsyndrome,aformofLaurence?Moon-BiedlsyndromeNewEng[J]. 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