SSF和SHF工艺发酵紫茎泽兰生产燃料乙醇的比较研究

毕业设计(论文) SSF和SHF工艺发酵紫茎泽兰生产燃料乙醇的比 较研究 COMPARATION OF SSF AND SHF TECHNOLOGY FOR FUEL ETHANOL PRODUCTION USING FERMENTATED EUPATORIUM ADENOPHORUM SPRENG 学生姓名 学院名称 化学化工学院 专业名称 应用化学 指导教师 年 月 日 徐州工程学院毕业设计(论文) 徐州工程学院学位论文原创性声明 本人郑重声明: 所呈交的学位论文～是本人在导师的指导下～独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用或参考的内容外～本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体～均已在文中以明确方式标注。 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名: 日期: 年 月 日 徐州工程学院学位论文版权协议书 本人完全了解徐州工程学院关于收集、保存、使用学位论文的规定～即:本校学生在学习期间所完成的学位论文的知识产权归徐州工程学院所拥有。徐州工程学院有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的纸本复印件和电子文档拷贝～允许论文被查阅和借阅。徐州工程学院可以公布学位论文的全部或部分内容～可以将本学位论文的全部或部分内容提交至各类数据库进行发布和检索～可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 论文作者签名: 导师签名: 日期: 年 月 日 日期: 年 月 日 I 徐州工程学院毕业设计(论文) 摘要 利用丰富而廉价的害草紫茎泽兰生产燃料乙醇，对我国经济和社会的可持续发展具有十分重要的意义，又解决了紫茎泽兰这种入侵植物的困境。 本文对各种预处理脱木素，发酵酶解做了一定的比较研究。NaOH和双氧水+NaOH预处理后的效果最好，木素去除率可达到65%左右。乙醇和甘油去除率只有34%和46%。 几种预处理后的酶水解中，乙醇处理后酶水解的还原糖得率最高，有81.92%。略高于NaOH处理过后的74.60%。同步糖化发酵和分步糖化发酵相比，同步糖化发酵的效率比较高，工艺更加好。并且在50小时左右乙醇产量就到达了较高值，为41g/L。该结论对以后的工业化生产具有指导意义。 关键词 紫茎泽兰;脱木素;酶水解;发酵生产;燃料乙醇 II 徐州工程学院毕业设计(论文) Abstract Weed Eupatorium adenophorum is a rich and cheap troublesome and can be used forfuel ethanol production. China's economic and social sustainable development has very important sense, also solves the invasive plant Eupatorium adenophorum dilemma. In this paper, the various delignification process, enzymehydrolysis and fermentation are done in order to obtain best process for ethanol production. NaOH and NaOH plus HO 22 treatment after acid pretreatment are carried out , and the mass removal rate can reach about 65%. Ethanol and glycerol while removing rate of only 34% and 46%. Reducing sugar yield after ethanol treated enzymatic hydrolysis is the highest value of 81.92%, which is slightly more than74.60% NaOH treated enzymatic hydrolysis. But ethanol can better protect the cellulose, an extraction effect, after the reduction of the cost of industrial production. Simultaneous saccharification and fermentation production efficiency higher than separated saccharification and fermentation. And in50 hours the ethanol yield reached a higher value,41g / L. The conclusion of the future industrialized production has direct sense. Keywords Eupatorium adenophorum; Delignification; Enzyme hydrolysis; Fuel ethanol III 徐州工程学院毕业设计(论文) 目 录 摘要 ................................................................................................................................. II Abstract ............................................................................................................................ III 1绪论 ................................................................................................................................. 1 1.1研究背景 ................................................................................................................. 1 1.1.1紫茎泽兰简介 .................................................................................................. 1 1.2紫茎泽兰的危害 ...................................................................................................... 1 1.2.1紫茎泽兰对农业、林业、牧业造成的危害 .................................................... 1 1.2.2 紫茎泽兰化学成分造成的危害 ...................................................................... 2 1.3紫茎泽兰综合利用的情况 ...................................................................................... 2 1.3.1农业上的利用 .................................................................................................. 2 1.3.2工业上的利用 .................................................................................................. 2 1.3.3紫茎泽兰在能源方面的应用 ........................................................................... 3 1.4紫茎泽兰发酵酶解产燃料乙醇 ............................................................................... 3 1.4.1紫茎泽兰的主要成分 ...................................................................................... 3 1.4.2化学预处理 ...................................................................................................... 3 1.5纤维素生产燃料乙醇的原理 .................................................................................. 4 1.5.1同步糖化发酵法(SSF法) ........................................................................... 4 1.5.2分步糖化发酵法(SHF) ............................................................................... 4 2技术路线 ......................................................................................................................... 5 3实验过程 ......................................................................................................................... 6 3.1实验 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 ................................................................................................................. 6 3.2实验试剂与器材 ...................................................................................................... 6 3.2.1主要试剂.......................................................................................................... 6 3.2.2主要仪器.......................................................................................................... 6 3.3实验方法 ................................................................................................................. 6 3.3.1预处理 ............................................................................................................. 6 3.3.2固体 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 方法 .................................................................................................. 7 3.3.3液体分析方法 .................................................................................................. 8 3.3.4酶活的测定 .................................................................................................... 10 3.4分析数据小结........................................................................................................ 12 ......................................................................................................................................... 14 4结论 ............................................................................................................................... 16 致谢 ................................................................................................................................. 17 I 徐州工程学院毕业设计(论文) 参考文献 .......................................................................................................................... 18 II 徐州工程学院毕业设计(论文) 1绪论 1.1研究背景 能源在被不断得被消耗，环境在近来也都不容乐观，所以能源和环境问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 是21世纪全球将要面临的两大的挑战。不可再生能源日益不断的消耗已接近了极限，人类面临着能源和石油危机。而云南等地的则被一种叫紫茎泽兰的植物大量繁殖不能根除而头疼。紫茎泽兰又有高含量的木质纤维素，所以我们研究把紫茎泽兰通过预处理然后发酵酶水解生成燃料乙醇。这样既解决了能源不足的问题，又将紫茎泽兰这种毫无用处的植物化废为宝了。这里试验通过各种不能得预处理看酶解发酵的效果和相互影响的因素。 1.1.1紫茎泽兰简介 紫茎泽兰(Eupatorium adenophorum Spreng)，又叫解放草、破坏草、黑头草，属多年生草本植物,茎和叶柄均呈现紫色,干枯后渐渐成为棕色。世界小半范围内都有紫茎泽兰的存 [1]在，目前泛滥成灾的紫茎泽兰，已经成为了头号的世界性恶性杂草。在上世纪40年代左右，紫茎泽兰在中国缅甸边境传入我国南部，从此一发不可收拾，紫茎泽兰种子很轻，随风传播，种子落地发芽生长，3-4月开花，半年后它就成熟。紫茎泽兰拥有很强的适应能 [2]力，所以它不管在何生根发芽，都能够快速生长。虽然人们对它的治理力度也不小，但还是赶不上它的传播速度。紫茎泽兰的生态适应能力特强，在入侵的云南地区后，根据当 [3]地的气候条件和生态条件产生了明显的适应性变化，这种能力是当地植物远远不能相比的。紫茎泽兰入侵以后，使当地的土壤的肥沃程度下降，动物类群的数量大大减少，破坏 [4]了生物的多样性。云南如果想要经济快速发展，解决环境问题，那么紫茎泽兰的问题变得刻不容缓。 1.2紫茎泽兰的危害 紫茎泽兰的泛滥给云南当地带来了巨大的危害，不管是经济上还是生态上。 1.2.1紫茎泽兰对农业、林业、牧业造成的危害 紫茎泽兰的泛滥成灾抑制了当地其它植物的生长。紫茎泽兰对云南当地的农业、林业甚至是交通都造成了不同程度的破坏。经济林业区被紫茎泽兰入侵以后，林业区就会大大地降低林木质量和产量，小树苗吸收不到养分，然后死亡;如果在马路和河岸附近生长还会阻碍当地交通。 紫茎泽兰的大量出现破坏了当地的生态平衡，破坏了生态多样性。紫茎泽兰入侵当地草地后，快速吸收土壤里的养分使得草地的肥沃程度大大下降。20世纪80年代前的云南中部地区，森林被砍伐，被火烧，只要封山几年，经过修养，植物就漫山遍野，现在远远 1 徐州工程学院毕业设计(论文) 望去只能看见紫茎泽兰在那里“得意”得笑。它让山间小路被阻塞，也阻塞水陆交通，给当地的交通也带来了极为的不便。 紫茎泽兰入侵农田，大量繁殖，快速消耗了土壤中的养分，使土壤肥沃程度下降，紫 [5]茎泽兰还与当地作物争夺阳光和水分，一定程度上降低了农作物的产量。 紫茎泽兰被牛羊误食还会造成牛羊的营养不良，严重的将会死去。 1.2.2 紫茎泽兰化学成分造成的危害 紫茎泽兰的茎杆主要由木素、纤维素、半纤维素、内溶物等组成;其叶子的主要组成成分是酚类、叶绿素、半纤维素、胶质和单宁。 紫茎泽兰含有多种易挥发的成分，在做实验的时候经过预处理后，气味都留在了液体中，用有机容易可以抽提，这些挥发成分对人畜具有一定的刺激作用。在紫茎泽兰开花时节，人们很容易吸入紫茎泽兰花粉，花粉颗粒细小，吸入过量会引发花粉过敏、喉咙不适、打喷嚏等不良反应。 在紫茎泽兰泛滥成灾的地区，放在外面放养的牛羊误食少量紫茎泽兰，时间长了发现那些牛羊没有胃口，逐步消瘦、生病然后死去。造成了养殖户的经济损失。 1.3紫茎泽兰综合利用的情况 紫茎泽兰的泛滥使国内外许多科研者都头痛不已，对它也进行了生物天敌治理研究、化学药剂治理研究以及机器铲除然后进行焚烧等，但是各种办法都成效不大。近几年来，能源短缺，人们随之改变了对紫茎泽兰的处理方法，积极开发利用紫茎泽兰当作能源，化肥为宝，创造经济利益。 1.3.1农业上的利用 ，[67]紫茎泽兰含大量的磷、氮、钾以及丰富的微量元素，有极大的资本当作有机肥料。百姓早在上世纪70年代就将其嫩叶堆、踩于水田和粪池中作为肥料用来灌溉农作物。紫茎泽兰虽然含有有毒成分，但经过脱毒以后，其有毒物质显著降解，家畜吃了这些脱毒饲 [8]料后也并未发生任何的不适，还减少了饲料的成本，增加了农民收入。紫茎泽兰成分中含有少量活性物质，对蚜虫等害虫有一定的除虫效果。因此用紫茎泽兰抽提的精油可小批 ，[67]量的生产杀虫剂，作为生物农药的新来源。 1.3.2工业上的利用 紫茎泽兰成分特殊，一些微量成分可以提纯做药，民间早有用其叶擦拭伤口。 由于紫茎泽兰的纤维素含量高，所以可用来加工成纸板、压模板，刨花板等生产建筑用模板。我们为人口大国，但是森林资源却极度短缺，人均更加是低的可怕。利用紫茎泽 [9]兰生产刨花板来缓解木材的供需矛盾，有利于生态以及环境保护。 2 徐州工程学院毕业设计(论文) 1.3.3紫茎泽兰在能源方面的应用 利用化学、机械、生物等各种手段在一定手段上防治紫茎泽兰了蔓延，但是流失了能 [10]源。紫茎泽兰脱毒以后可以用作沼气发酵的原料，虽然有实验表明紫茎泽兰可能会引起 [11]酵母菌的中毒这种现象，固而不能直接当作原料来生产燃料乙醇的，方法比较繁琐。 直接燃烧紫茎泽兰，造成了能量的大量流失并且造成了环境的污染。发酵产沼气，则有时间长，并且要进行脱毒处理。为了提高效率，有科研人员研发了产氢产甲烷联合发酵的方法。 1.4紫茎泽兰发酵酶解产燃料乙醇 紫茎泽兰直接当作木头来烧，热值的利用效率太低。发酵产沼气要进行脱毒处理，步骤比较繁琐。所以我们决定尝试下发酵酶解产燃料乙醇。 1.4.1紫茎泽兰的主要成分 紫茎泽兰中含有大量的木质纤维原料，是生产燃料乙醇的天然资源。 1.4.1.1木质纤维原料的主要组成 在木质纤维原料中，大部分化学成分以纤维素和半纤维素为主，一般有60%-80%。木 [12]素也占了不可或缺的部分，它使植物更加坚韧 。 木素在植物中的作用相当于人体中的骨架，所以预处理要破坏去除它。 1.4.1.2木质纤维原料主要组分与预处理的关系 纤维素水解后得到的葡萄糖是微生物发酵的主要原料，所以在预处理过程中，应尽量减少纤维素的损失，以减少成本，对工业生产的各种细节都很重要。半纤维素则像一层膜，它阻碍了纤维素酶与纤维素的接触，所以预处理要戳个这层膜,减低半纤维素含量。但是相比木素对酶水解的影响,半纤维素却又要小巫见大巫了。木素是阻碍木质纤维原料酶催化水解的最大的影响因素。因此，我们就有必要在预处理的时候尽量多脱除木素。我们做了第1次稀硫酸预处理时发现木素脱除效果一般，所以又设计了2次处理第1次的处理样, [13]然后进行比较。 1.4.2化学预处理 1.4.2.1碱预处理 碱预处理所涉及的应用，包括添加氢氧化钠与KOH等方案去除木质素，半纤维素的一部分，这样能显著地提高可及性的纤维素酶。碱预处理可以使糖化产量大幅增加。预处理可以在较低的温度下进行,但有一个相对较长的时间和高浓度的溶液。比起酸或氧化试剂、碱处理方式似乎是最有效的。其方法在打破木质素、半纤维素和纤维素，避免分裂其他聚合物。 3 徐州工程学院毕业设计(论文) 1.4.2.2酸预处理 木质纤维素酸预处理，在室温厌氧条件下能提高转化率。稀酸预处理主要影响的是半纤维素和木质素降解。酸预处理将使纤维素更好的被酶分解。酸预处理使用的酸有稀硫酸、稀盐酸和草酸等。稀酸处理后，采用纤维素酶水解酶处理余下的含碳水化合物的生物资源。稀酸预处理可以是一个简单的单级过程，过程中需要适合稀释倍数，适合的反映时间，和固液比等。 1.5纤维素生产燃料乙醇的原理 用纤维素生产燃料乙醇的关键就是把大量的纤维素酶水解为葡萄糖，算是第一步的糖化过程。当纤维素水解为单糖以后，再加酶加菌种发酵生成乙醇等物质。酶水解工艺被专家认为是环保且低成本的工艺。 1.5.1同步糖化发酵法(SSF法) 同步糖化发酵法(SSF)法指酶解发酵同时在同一容器中同时进行，使糖化产生的纤维二糖和葡萄糖转化为乙醇。相比SHF，SSF在工艺上采简化了设备，节约了生产的时间，提高了生产效率，节约了能源,可以创造更加大的经济效益。但SSF法也不是如此完美,它也存在一些抑制因素，如糖化温度和发酵温度不协调，木质纤维素预处理过程中的有毒物质会对菌种的发酵和纤维素酶的活性有一定抑制作用，使酶的活性降低，微生物一酶的兼容性也成为了同步糖化发酵法的一个难题。 1.5.2分步糖化发酵法(SHF) 分步糖化发酵(SHF)是较传统的工艺，它分成两步走，第一步先将纤维素转为葡萄糖，第二步将葡萄糖进一步通过发酵产出燃料乙醇。在分步糖化发酵过程中，存在着下面这些问题。?在纤维素糖化过程中，酶解过程产生的单糖和纤维二糖对纤维素酶存在着很强的反馈抑制，使糖化率没SSF高;?纤维质原料比容大，所以分批水解液糖浓度相对变低;?由于实验要先酶水解，再进行发酵，操作比较复杂且发酵周期变长导致设备投资大， [14]增加成本，还容易污染染菌种。 4 徐州工程学院毕业设计(论文) 2技术路线 原料分析 粉碎，脱水，原料粉碎 恒重 酸/碱/有机溶剂/氧化 物质预处理 固液分离 1 称重 同步糖化发酵，加酶 2 差重法(下面介绍)分析纤固体 发酵同时进行 维素、半纤维素、木质素 3 红外 纤维素酶水解 固液分离 1 测量体积 2 DNS测还原糖 液体 3 苯酚硫酸法测 总糖 4地衣酚测木糖 发酵 测乙醇含量 5 徐州工程学院毕业设计(论文) 3实验过程 3.1实验材料 原料紫茎泽兰取自云贵高原。经过自然风干后，通过4mm(60目)的栓孔粉碎。105?恒温干燥24h，在烘箱里放着。 3.2实验试剂与器材 3.2.1主要试剂 HCl、HSO、NaOH、中性试剂、乙醇、甘油、葡萄糖、DNS试剂、地衣酚、苯酚、24 丙酮、吐温试剂、表面活性剂、纤维素酶、β葡萄糖苷酶 1%水杨苷:准确称取1.0000g水杨苷，用0.05 mol?L-1 pH4.8 柠檬酸缓冲液溶解并定容至100mL。 中性试剂:称18.6g乙二胺四乙酸二钠、4.56g无水磷酸氢二钠、6.8g硼酸钠、30g十二烷基硫酸钠放入1000mL刻度的烧杯中，加入800mL蒸馏水，再加搅拌子，加热搅拌熔解，最后加入10mL乙二醇乙醚当作消泡剂，定容到1000mL保存使用。 3.2.2主要仪器 表3-1 实验的主要仪器 设备 型号 产地 9FZ-35 多动能粉碎机 山东泰安市 SHZ-C 数显水浴恒温振荡器 上海 UV751GD 紫外可见分光光度计 上海 SHZ-D 真空循环水式抽滤机 巩义市 FA1004A 电子天平 上海 DHG-9146A 电热恒温鼓风干燥箱 上海 pHS-3C PH计 上海 HH-4 数显恒温水浴 常州 SW-CJ-1FD 洁净工作台 苏州 LRH-250 生化培养箱 上海 800 台式电动离心机 江苏 3.3实验方法 3.3.1预处理 采用粉碎过的干燥的紫茎泽兰进行预处理和分析。在120?C，2.5h，液固比12:1(mL/g)，H2SO4浓度为1.5%的条件下反应。取部分处理原料烘干进行分析。 NaOH处理:将酸处理后的原料放入2%的NaOH溶液中，120?C下处理1h，先用少量的稀酸洗涤，再水洗至中性，105?C下烘干。 NaOH+H2O2处理:将酸处理后的原料放入2%的NaOH+2%的H2O2的溶液中，120?C下处理1h，先用少量稀酸洗涤，再水洗至中性，105?C下烘干。 6 徐州工程学院毕业设计(论文) 乙醇处理:将酸处理后的原料放入40%的乙醇溶液中，180?C下处理30min，先用少量40%的乙醇洗涤，再水洗至中性，105?C下烘干。 甘油处理:将酸处理后的原料放入70%的甘油溶液中220?C下处理3h，先用少量甘油洗涤，再水洗至中性，105?C下烘干。 3.3.2固体分析方法 样品先在80?烘干4小时，再取1.0000g(计为m)置于250mL的碘量瓶中，加入100mL 中性洗涤剂，之后放入已沸的恒温水温锅中，100?保温1h，取用布式漏斗过滤，残渣 用水洗、丙酮洗，80?干燥，冷却至恒重称量W0。 残渣 滤液(弃去) 置于250mL的碘量瓶中，加入100mL的2mol/mL的盐酸溶液，放入已沸的恒温 水浴锅中，100?保温50min，取出用布式漏斗过滤，水洗残渣至Ph6.5,7.0，80? 恒温干燥，冷却恒重称量W1。 残渣 滤液 60?干燥然后置入50 mL的 烧杯中，加入10 mL的72% HSO,20?水解3h,然后加入24用2mol/mL的盐酸稀释6倍，再 90 mL的水，反应15h，次日用稀释的盐酸做 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 样于205nm用布式漏斗过滤，水洗残渣 测A值 至pH6.5，80?恒温干燥，冷木素含量=(A-A0)V/KW 却恒重称量W2。 W-试料质量g V-溶液体积L A-试料测定时的吸收度 于80?烘干，用3%硫酸稀释再3%硫酸标A0空白测定时的吸收度 之后再550?K-酸溶木素的吸收度L/(g*cm)取准样于205nm测A值 灰化1h，得灰木素含量=(A-A0)V/KW K值为110 分(W3) W-试料质量g V-溶液体积L A-试料测定时的吸收度 A0空白测定时的吸收度 半纤维素 K-酸溶木素的吸收度 L/(g*cm)取K值为110 木质素 7 徐州工程学院毕业设计(论文) 纤维素 半纤维素(%)=(W0-W1)/m×100% 纤维素(%)=(W1-W2)/m×100% 木质素(%)=(W2-W3)/m×100% 灰分(%)=W3/m×100% W0=中性试剂洗涤过烘干试样的质量，g W1=盐酸处理过后烘干试样的质量，g W2=硫酸处理过后烘干试样的质量，g W3=经过550?C灰化过后的试样质量，g 3.3.3液体分析方法 酶水解后的液体主要测量3个量，分别为葡萄糖，木糖和总糖。 3.3.4 DNS法测葡萄糖 1)试剂配制 l mg.mL-1木糖标准液:准确称取l00mg分析纯木糖(无水)，倒入烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，转移到100mL的容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，低温保存。 3，5-二硝基水杨酸试剂:称取3 ，5一二硝基水杨酸5 g，倒入于300mL蒸馏水中，慢慢加入氢氧化钠5g ，在50 ?水浴中搅拌进行溶解，再依次加入酒石酸甲钠100g、重蒸苯酚21g 、无水亚硫酸钠2.5g ，过段时间，等溶液全部溶解并澄清以后，冷却半小时，加水定容到500mL。储存在棕色试剂瓶中，避光，放置7天后使用。 2)标准曲线 表3-2 DNS测还原糖的步骤 实验步骤 取6支试管，编号0-6 0号 1号 2号 3号 4号 5号 -10 mL 0.2 mL 0.4 mL 0.6 mL 0.8 mL 1 mL 加木糖1mg•mL 加蒸馏水/mL 1mL 0.8 mL 0.6 mL 0.4mL 0.2 mL 0 mL -10 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 木糖的浓度/mg•mL 1 mL 加DNS 反应 沸水浴反应5min 取出水冷至室温 测定 加8 mL 蒸馏水定容到10mL，在540nm下测它的吸光度 3)样品测定 在试管中加入1.00mL发酵液，在冰水浴中加入1mLDNS，封口摇匀，沸水浴5min， 8 徐州工程学院毕业设计(论文) 取出水冷至室温，定容到10mL，测定光度计，并根据标准曲线计算出糖含量。 3.3.5地衣酚测木糖 试剂配制 地衣酚试剂:称取地衣酚0.1g溶于10ml95%乙醇，在棕色瓶中。 0.1%的三氯化铁溶液:称取三氯化铁带六个结晶水0.1668g溶于浓盐酸中，配置成100ml; 80 ug.mL-1L木糖:称取0.08g的木糖，定容的1000mL，配成的溶液 2)标准曲线 表3-3 地衣酚测木糖的步骤 实验步骤 取6支试管，编号0-6 0号 1号 2号 3号 4号 5号 -10 mL 0.1mL 0.2 mL 0.3mL 0.4mL 0.5mL 加木糖80ug•mL 1mL 0.9mL 0.8mL 0.7mL 0.6mL 0.5 mL 加蒸馏水/mL -10 8 16 24 32 40 木糖浓度/ ug•mL 加0.3ml的1%的地衣酚溶液和3ml的0.1%的三氯化铁溶液，加地衣酚 振荡 反应 沸水浴反应30min 取出水冷至室温 测定 在670nm下测它的吸光度 3)样品测定 在试管中加入1.00mL发酵液，加3ml的0.1%的三氯化铁溶液和0.3ml现配的地衣酚溶液，振荡，沸水浴30min，取出水冷至室温，测定吸光度，并根据标准曲线计算出糖含量。 3.3.6苯酚硫酸法测总糖 试剂配制 苯酚试剂:称取6.0g重蒸苯酚，加蒸馏水定容于100mL容量瓶。放入棕色瓶，低温下保存备用; 250ug/mL葡萄糖标准液:取干燥的葡萄糖标准品(104?烘干至恒重)0.0625g，加蒸馏水溶解，定容于250mL容量瓶，用前摇匀; 250ug/mL木糖标准液:取干燥的木糖标准品0.0625g，加蒸馏水溶解，定容于250mL容量瓶，用前摇均; 标准曲线1(曲线选择的基准以溶液中糖含量高的为准) 9 徐州工程学院毕业设计(论文) 表3-4 苯酚硫酸法测葡萄糖的步骤 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 葡萄糖标准液/mL 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 蒸馏水/mL 1.0 苯酚试剂/mL 5.0 浓硫酸/mL 0 25 50 75 100 125 150 175 200 葡萄糖浓度/(ug/mL) 静置20min，冷至室温 A490nm 样品测定 在试管中加入1mL待测液，再加入1mL苯酚试剂和5mL浓硫酸，在静置20min，冷 至室温，在一定的波长下测定，并根据标准曲线计算出糖含量。 3.3.4酶活的测定 酶活定义:在标准反应条件下，1 min将底物转化生成1μmol 产物所需要的酶量为一个 酶活单位 ,单位为 IU?mL-1。 (1)葡萄糖标准曲线的制定 配制1mg?mL-1的葡萄糖标准溶液:称取于105 ?下烘干至恒重的无水葡萄糖0.5g , 用柠檬酸缓冲液溶解并定容至500mL。 取6支干燥的试管，依次编号 按表所示的量，加入l mg•mL-1的葡萄糖标准液和少量DNS试剂 摇匀，然后放沸水浴中加热5min 取出后放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温 慢慢加蒸馏水定容至10mL刻度处，颠倒混匀 在540nm波长下，用0号管作标样，依次 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 1-5号管的OD值 以OD值为纵坐标，葡萄糖mg为横坐标，做标准曲线，求得直线方程以供下面使用 表3-5 各试管加溶液和试剂的量 -1管1mg?mL葡萄糖光密度蒸馏水 柠檬酸缓冲液葡萄糖含量DNS/mL /mL /mL /mg 号 标准液/ mL 值 0 0 1 0.5 3 0 0 1 0.2 0.8 0.5 3 0.2 0.088 2 0.4 0.6 0.5 3 0.3 0.225 10 徐州工程学院毕业设计(论文) 3 0.6 0.4 0.5 3 0.4 0.363 4 0.8 0.2 0.5 3 0.5 0.492 5 1 0 0.5 3 0.6 0.622 图3-1 葡萄糖的标准曲线 (2)测定 ?β-葡萄糖苷酶活力测定: 取4支具有25mL刻度的刻度试管编号0-3， 0号不加酶液，1-3号加入 0.5 mL 适当稀释的澄清酶液 -1加入1.0 mL 用0.05 mol?L pH4.8 的柠檬酸缓冲液配制的 1 %水杨苷溶液摇匀 在50?下反应30 min 取出0号加0.5 mL酶液，迅速加入DNS溶液3 mL 100 ? 煮沸5 min 水浴冷却后，加蒸馏水定容至10mL刻度处，颠倒混匀 在540nm波长下，用0号管作空白，依次记录1-3号管的OD值 根据事先做出的葡萄糖标准曲线算出反应生成的糖量(mg), 求得β-葡萄糖苷酶 活力 11 徐州工程学院毕业设计(论文) 3-1 生成的还原糖量(mg)×稀释倍数×10 β-ase (IU?mL)= -1180(g?mol )× 酶液的体积(mL)×30(min) 平均0D值为0.179 葡萄糖含量为(0.179+0.176)/0.1335=0.266mg -1 β-ase (IU?mL)=0.266×2000×1000/(180×0.5×30)=197 ?滤纸酶活测定: 取4支具有25mL刻度的刻度试管编号0-3， 0-3试管各加50 mg滤纸 0号不加酶液，1-3号加入 0.5 mL 适当稀释澄清酶液 -1再加1.0 mL 用0.05 mol?L pH4.8 的柠檬酸缓冲液 在50?下反应60 min 取出0号加0.5 mL酶液，迅速加入DNS溶液3 mL 100 ? 煮沸5 min 水浴冷却后，加蒸馏水定容至10mL刻度处，颠倒混匀 在540nm波长下，用0号管作空白，依次记录1-3号管的OD值 根据事先做出的葡萄糖标准曲线算出反应生成的糖量(mg)，求得滤纸酶活力 3 生成的还原糖量(mg)×稀释倍数×10 -1-1 FPA (IU?mL) = 180(g?mol )× 酶液的体积(mL)×60(min) 平均OD值为0.583 所以葡萄糖含量=(0.583+0.176)/1.335=0.569 mg -1FPA (IU?mL) =0.569×2000×1000/(180×0.5×60)=210 3.4分析数据小结 将硫酸处理过的紫茎泽兰进行第2次预处理，来充分地脱除木素。 12 徐州工程学院毕业设计(论文) 图3-2 4种2次预处理脱除木素的比较 从上图可以看出乙醇和甘油这些有机溶剂的脱木素效果没有碱处理和碱性氧化剂的效果好。 图3-3 酶水解后还原糖得率和总糖得率的比较 从上图可以看出乙醇和甘油这些有机溶剂的糖得率比碱处理的效果好，酶解得较充分。 13 徐州工程学院毕业设计(论文) 图3-4 几种预处理后的固体的红外光谱图 在上图中有很多特征峰，有几个峰和实验比较有关联。 1)900cm-1处，β糖苷键的特征峰，吸收强度变弱，想比原来，3种预处理过后的峰强度都较弱，表明3种预处理后是碳水化合物都有一定分解。 2)1237cm-1处，半纤维素特征峰，NaOH处理过后的峰强度最大，加双氧水的NaOH次之，硫酸的最低，所以NaOH处理脱半纤维素的效果最好。 3)1372cm-1处，纤维素特征峰，NaOH和加双氧水的NaOH峰强度差不多，均略大于硫酸的，含量比硫酸和原来的要高。 14 徐州工程学院毕业设计(论文) 图3-5 分步糖化发酵图 从上图看出，分步糖化发酵耗时较长。72小时左右可达到40g/L。 图3-6 同步糖化发酵图 从上图看出，分步糖化发酵乙醇到达饱和值用时较短，50小时左右可达41g/L。 15 徐州工程学院毕业设计(论文) 4结论 NaOH和加双氧水的NaOH预处理酸处理后的效果最好，去除率可达到65%左右。乙醇和甘油虽然去除率只有34%和46%，但是纤维素消耗的少。 乙醇酶水解的还原糖得率最高，有81.92%。虽然木素除的少，但是糖得率反而上来了，估计可能和半纤维素的含量等有关，毕竟有机容易做的是抽提，而碱性氧化剂则破坏了紫茎泽兰的结构。 同步糖化发酵的工艺效率优于分步糖化发酵，比较有实际意义。 16 徐州工程学院毕业设计(论文) 致谢 本论文是在王欲晓老师的悉心指导下完成的。一步步地分析课题，了解课题到确定再到最后完成，王老师都给了我足够的教诲和支持。教会了实验的原理，技巧，甚至还有些以后做人的道理。王老师严谨求实的科学作风，诲人不倦的教育精神，深深鼓舞着我和激励着我，让我坚持完成了实验和论文。在这里向王老师表达崇高的敬意和诚挚的谢意。并祝愿王老师身体健康，生活中万事如意，实验室做出更多的科研成果。 同时还要感谢化学化工学院的各位领导和各位老师，谢谢你们这四年来的细心栽培，预祝我们化学化工学院的明天更加辉煌～～ 还要感谢和我一起做毕业设计的同学，和你们一起，我学到了更多的知识。 最后还要感谢我的父母，他们培育了我，给了我经济上的支持，祝福你们身体健康～谢谢。 17 徐州工程学院毕业设计(论文) 参考文献 [1]冯玉元.变害为宝的紫茎泽兰[J].中国林业, 2004,(17): 37. [2]刘伦辉,谢寿昌,张建华.紫茎泽兰在我国的分布、危害及防除策略的探讨[J].生态学, 1985, 5(1): 1-6. [3]强胜.用AFLP技术分析紫茎泽兰的遗传多样性[J].南京农业大学学报, 2004, 27(1): 62-66. [4]桂富荣.紫茎泽兰的遗传多样性及其种群结构分析[D].北京:中国农业科学院, 2006. [5]侯太平,刘世贵.有毒植物紫茎泽兰研究进展[J].国外畜牧学-草原与牧草, 1999, (4): 6-8. [6]汪禄祥,刘家富,束继红.有害杂草的微量元素分析[J]. 广东微量元素科学, 2002, 9(6): 68-69 [7]殷彩霞,彭莉,周纪勤,等.云南药用菊科植物微量元素含量聚类分析[J].广东微量元素科学, 1998, 5(7): 61-66. [8]张仕伟.催腐剂快速堆腐紫茎泽兰成肥[J].云南农业, 1999, (9): 22. [9]杨正东.紫茎泽兰刨花板生产技术的开发与研究[J].林业机械与木工设备, 2002, 30(4): 10-12. [10]江蕴华,余晓华.紫茎泽兰生产沼气的研究[J].太阳能学报, 1986, 7(3): 288-294. [11]刘士清,朱海春,尹芳,等.利用紫茎泽兰毒性复壮酵母发酵产酒精的试验[J].农机化研究, 2008, (6): 121-125. [12]杨淑蕙.2001.植物纤维化学[M].北京:中国轻工业出版社. [13]张黎华，赵冰雪,不同预处理对紫茎泽兰和飞机草的研究. [14]夏黎明.可再生纤维素资源酶法降解的研究进展.林产化工通讯，1999， (01):23-28 [15]孙启铭.野生有机肥料资源紫茎泽兰的利用[J].农业科技通讯, 2002, (4): 28-29. 18