DNA重组、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

DNA重组、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 DNA重组、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 DNA重组 DNA重组(基因重组)是指，由不同DNA链的断裂和连接而产生DNA片段的交换和重新组合，形成新DNA分子的过程。 原核生物的基因重组有转化、转导和接合等方式。受体细胞直接吸收来自供体细胞的DNA片段，并使它整合到自己的基因组中，从而获得供体细胞部分遗传性状的现象，称为转化。通过噬菌体媒介，将供体细胞DNA片段带进受体细胞中，使后者获得前者的部分遗传性状的现象，称为转导。自然界中转导现象较普遍，可能是低等生物进化过程中产生新的基因组合的一种基本方式。 高等动植物中的基因重组通常在有性生殖过程中进行，即在性细胞成熟时发生减数分裂时同源染色体的部分遗传物质可实现交换，导致基因重组。 基因重组是杂交育种的生物学基础，对生物圈的繁荣昌盛起重要作用，也是基因工程中的关键性内容。基因工程的特点是基因体外重组，即在离体条件下对DNA分子切割并将其与载体DNA分子连接，得到重组DNA，并将其导入到受体中(微生物或高等动植物)，从而使受体获得某些有益性状。1977年美国科学家首次用重组的人生长激素释放抑制因子基因生产人生长激素释放抑制因子获得成功。此后，运用基因重组技术生产医药上重要的药物以及在农牧业育种等领域中取得了很多成果。 1 质粒 把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达的工具叫载体(Vector)。YAC、BAC、噬菌体、细菌质粒等是重组DNA技术中常用的载体。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性:(1)分子量小、多拷贝、松驰控制型;(2)具有多种常用的限制性内切酶的单切点;(3)能插入较大的外源DNA片段;(4)具有容易操作的检测表型。 质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。 质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒‎‎相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部 2 分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列,这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript(简称pBS)等。质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(,10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。 本实验中应用T载体转化受体菌E. coli DH5α的菌株。由于T载体上带有Ampr 和lacZ基因,故重组子的筛选采用Amp抗性筛选与α-互补现象筛选相结合的方法。 因T载体带有Ampr (氨苄青霉素耐受)基因,故转化受体菌后只有带有T载体 DNA的转化子才能在含有Amp(氨苄青霉素)的LB平板上存活下来; 而未获得转化的空细菌则不能存活。此为初步的抗性筛选。 T载体上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常功能。E. coli DH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下, T载体和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在T载体和DH5α融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳 3 糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补。由α-互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到T体质粒的多载‎‎克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去α-互补能力, 因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。在LB培养基上，α-互补产生的Lac+细菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解LB培养基中的X-gal，产生蓝色菌落，而当外源片段插入后，失去α-互补能力，因而不产生β-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的X-gal，菌落呈白色。由此可将重组质粒与自身环化的载体DNA分开。此为α-互补现象筛选。 注:X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)以半乳糖苷酶(b-galactosidase)水解后生成的吲哚衍生物显蓝色。 IPTG是异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylthiogalactoside)，为 非生理性的诱导物，它可以诱导lacZ的表达。 连接策略 外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种: (1)带有相同的粘性末端 用相同的酶或同尾酶处理质粒和外源片段，即可得到这样的末端。但是在连接反应中值得注意的是，由于质粒和外源片 4 段本身可能含有两个相同粘性末端，因此均可能发生质粒的自身环化或外源片段形成的寡聚物, 而且正反两种连接方向都可能有。所以，必须在实验 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 中尽可能保证正确连接产物的数量达到最高，同时需进行后续阳性克隆的筛选。 (2)带有非互补粘性末端 用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这也是最容易克隆的DNA片段，一般情况下,常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为‎‎加上不同酶切位点以便与载体相连。 (3)带有平末端 是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶补平所致。由于在连接反应中，平端的连接效率比粘性末端要低得多，故使用T4 DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG 8000)以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。 特殊情况下，外源DNA分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配,则可以在线状质粒载体末端或外源DNA片段末端接上合适的接头(linker)或衔接头(adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶?的klenow大片段部分填平3'凹端,使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连 5 接。 转化 转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2,RbCl等化学试剂法)的处理 后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。 目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl 法简便2易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15,的无菌甘油于-70?保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。 为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素: (1)细胞生长状态和密度: 6 不要用经过多次转接或储于,?的培养菌，最好从,70?或-20?甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，密度过高或不足均会影响转化效率。 (2)质粒的质量和浓度: 转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA量过多或体积过大时,转化效率就会降低。一般情况下，1ng的DNA即可使50μl 的感受态细胞达到饱和，同时DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5,。 (3)试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并2 存于干燥的冷暗处。 用超纯水配制,最好分装保 (4)防止杂菌和杂DNA的污染: 整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿、离心管等需经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌或过滤除菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染。 本实验方案 本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞,并用CaC处理l,使2其处于感受态(本实验购买了商品化的感受态),然后与pBS质粒共保温,实现转化。由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入 7 pBS，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞(转化子)肯定已导入了pBS。带有插入片段的转化子由于破坏了半乳糖苷酶基因,呈白色;不带外源片段的转化子可以分解X-gal，呈兰色。将白色转化子挑出后扩大培养，PCR鉴定后进一步酶切鉴定。 一、 试剂材料及设备 试剂:X-gal储液(20mg/ml) ，IPTG储液(200mg/ml) ，LB液体培养基，0.1mol/L的CaCl溶液，Amp母液，含Amp的LB固体培2 养基，含X-gal和IPTG的筛选培养基，pMD18-T vector; 注:具体配方见实验六后附录 材料:外源DNA片段:——PCR纯化回收产物，载体DNA—— pBS质粒(Ampr ,lacZ)，E. coli DH5α菌株—— Rˉ,Mˉ,Ampˉ; 设备:恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅， 琼脂糖凝胶电泳装置， 电热恒温培养箱，电泳仪，无菌工作台， 微量移液枪，eppendorf管，低温冰箱,制冰机, 分光光度计 二、实验步骤及注意事项 (一)连接反应 1、样品混匀 冰上溶解solution I、vector及重组DNA片段等，涡旋混匀并短暂离心。 8 2、配制连接体系 按下列顺序在加入各种成分, 建立连接反应。 成分 体积 vector 0.5μl 纯化产物 4.5μl Total 5μl 注:纯化产物的使用量——0.1pmol-0.3pmol; 3、 加入Solution I Solution I的体积为5μl，轻轻吹吸混匀。 4、 连接反应 16?连接30min(水浴或PCR仪进行)。 (二)感受态细胞的制备 ( CaCl2 法) 1、 受体菌的培养 从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于5m l LB液体培养基中,37?下振荡培养12小时左右(过夜),直 至对数生长后期;将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于 50ml LB液体培养基中,37?300转振荡培养3小时至OD600 ,0.5左右。 2、 收集菌体 将5ml培养液转入预冷的离心管中,冰上放置10分钟,然后于4?下4000转离心10分钟。 3、 CaCl2悬浮细胞，制备感受态 9 弃上清，用预冷的0.1mol/L的CaC l溶液1ml轻轻悬浮细胞, 2 4?下4000r/min离心10分钟。弃去上清, 倒出培养液，将管 倒置几秒钟以使最后残留的痕量培养液流尽。 加入0.2ml预冷0.1mol/L的CaCl溶液,轻轻悬浮细胞,转入2 1.5ml离心管，冰上放置20分钟,即成感受态细胞悬液。 4、 感受态细胞冻存 3中用含15%甘油的0.1mol/L的CaC溶液代替普l通预冷Ca2 Cl溶液，重悬细胞,即可贮存于-70?可保存半年。 2 使用时从-70?冰箱中取出感受态细胞悬液,室温下使其解冻, 解冻后立即置冰上。 (三) 转化 1、 混合 冰上迅速解冻感受态细胞，取50μl + 重组DNA5μl，用手指轻弹混匀; 置于冰上，静置30min，使二者充分结合; 注:1)解冻感受态细胞，动作要快;以免影响细胞转化效率; 2)重组DNA质粒解冻后，混匀，瞬间离心再取; 3)质粒含量不宜过多，一般不超过50ng，体积不超过10μl; 4)感受态细胞和DNA混匀时不要用‎‎枪吹打，以免影响细胞转化效率; 2、 热击 10 42?水浴，热击45秒,后迅速置于冰上冷却2-3分钟，过程中不要摇动离心管。 注:1)热击操作使DNA进入感受态细胞; 2)不同感受态细胞，热击时间亦有所不同; 3)冰上迅速冷却，使得DNA在感受态中稳定; 3、 菌的增殖 加入不含抗生素(Amp)的LB液体培养基500μl混匀，37?振荡1小时(转速为200转/分)。 注:此步骤主要是为了使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因。 4、 铺板 取100μl的菌液加到含Amp及IPTG(4ul)/X-gal(40ul)的筛 选平板上，用涂布棒小心涂布均匀;室温正置1小时左右，使菌 液完全被培养基吸收; 注:1)含Amp及IPTG/X-gal的筛选平板需要事从冰箱中取出，倒置，使之恢复室温; 2)涂布的菌液量要适当，以免形成的菌落密度过密或过稀，不利于后续挑菌。 5、 过夜培养 倒置培养皿,37?培养箱中静置培养过夜。 注:1)倒置培养是防止冷凝水浸润到培养基中; 2)静置培养时间不宜过长，时间过久会出现“卫星菌落”。 11 附录:试剂配方 1、 X-gal储液(20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的储液, 包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏, 储存于-20?。 2、IPTG储液(200mg/ml): 在800μl蒸馏水中溶解200mg IPTG后,用蒸馏水定容至1ml,用0.22μm滤膜过滤除菌‎‎，分装于eppendorf管并储于-20?。 3、含X-gal和IPTG的筛选培养基:在事先制备好的含50μg/ml Amp的LB平板表面加40μl X-gal储液和4μlIPTG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,备用。 4、Amp母液:配成 50mg/ml水溶液, -20?保存备用。 5、含Amp的LB固体培养基: 液体培养基中每升加15g琼脂粉,高压灭菌。 冷却至60?左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。 6、0.1mol/L的CaCl溶液:溶于重蒸水中,定容后过滤灭2 菌。 7、LB液体培养基(20g/L) :LB固体粉末20g，加入1L自来水，溶解后高压灭菌。 8、质粒重组试剂盒:pMD18-T vector (TaKaRa) 12 13 实验七 重组克隆的蓝白斑筛选 一、材料与试剂 试剂:含重组DNA片段的E. coli DH5α菌株，Amp母液( 50mg/ml水溶液)，LB液体培养基，PCR试剂盒 仪器:牙签、恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅， 琼脂糖凝胶电泳装置， 电热恒温培养箱，电泳仪，无菌工作台，微量移液枪，eppendorf管，低温冰箱 二、实验步骤与注意事项 1、阳性克隆筛选 取过夜倒置培养的平板，观察平板:是否出现明显而又未相互重叠的单菌落 注:1)如果未出现菌落或菌落较小，可以延长培养时间。 2)在含X-gal和ITPG的LB培养基上，带有插入片段的重 组质粒转化子，应呈现白色菌落，因为插入片段破坏 了原载体中β-半乳糖苷酶活性;带有空载体的转化 子，由于具有β-半乳糖苷酶活性,为蓝色菌落;不带 有质粒载体DNA的细胞,由于无Amp抗性,不能在含有 Amp的筛选培养基上成活。 2、挑阳性菌 用牙签随机挑取白色重组菌，沾至含有Amp抗生素1ml液体 14 LB培养基中，37度培养过夜(转速200转/分)。 3、菌落PCR 1)菌液模板的获取 取0.2ml过夜培养的菌液于1.5ml离心管中，沸水浴5分钟。 12000rpm，离心3分钟。 2)配制PCR体系——25μl 模板:取2μl上清作为模板; 引物:pGE-T Vector 多克隆位点两侧的序列; 或从基因组中扩增出片段时所用的引物。 反应体系: 组分(工作浓度)体积 终浓度 10×Buffer 2.5μl 1× dNTP(10mM) 0.5μl 200μM 2μl 0.2μM 引物(上下游 2.5μM) 2μl 100ng 菌液 Taq(5U/μl) 0.25μl 1.25U 灭菌ddH2O 补齐 25μl 15 3)PCR反应条件 94? 预变性2 分钟 ? 94? 变性30 秒 57? 退火30 秒 28 cycles 72? 延伸30秒 ? 72? 延伸5分钟 4)电泳 取10μl PCR产物，加入上样缓冲液，1.5%琼脂糖电泳检测插入片段的大小是否与目的基因一致。 16 实验八 质粒DNA的提取、酶切及电泳检测 质粒DNA的提取与电泳 基本步骤 培养细菌使质粒扩增;收集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA 17 。 实验原理 采用十二烷基磺酸钠(SDS) 或Triton X-100可使细胞膜裂解。经SDS或Triton X-100处理后,细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA)的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性而与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。 电泳检测 在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA, 简称 ocDNA);如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA)。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳‎‎动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。 酶切鉴定 18 限制性内切酶 能特异地结合限制性酶识别的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。如EcoR?切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 5'„G?AATTC„3' ? 5'„ G AATTC„3' 3'„CTTAA?G 5 ? 3'„ CTTAA G„5' 酶切反应影响因素 DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响酶切反应的效率。 DNA:大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶‎‎贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。 缓冲液:如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70?低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。 酶切图谱 DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表 19 示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。 在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般DNA用量约为0.5-1μg。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37?)。对质粒DNA酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶,消化1-2小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加2-3倍,甚至更多,反应时间也要适当延长。 一、试剂 1、溶液?:50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。 溶液?可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌(6.895*104Pa)15分钟,储存于4?冰箱。 2、溶液?:0.2 mol/L NaOH (临用前用10mol/L NaOH母液稀释)，1, SDS。 3、溶液?:5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.5ml，定容至100ml, 并高压灭菌。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L。 4、RNase酶10mg/ml 5、STE:0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris?Cl(pH8.0)，1mmol 20 /L EDTA (pH8.0)。 二、实验步骤与注意事项 1、接菌 用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基(含50μg/ml Amp)中,37?振荡培养 约12小时至对数生长后期。 后续步骤2-4为质粒DNA少量快速提取(碱法) 该方法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。这些方法共同特点是简便、快速，能同时处理大量试样,所得DNA有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。 注:提取过程保持低温稍好。 2、菌体的收集 取5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中(多次离心在同一管中进行，将沉淀一并收集), 12000g离心30秒。弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。 注:菌液量要适当，太少可能无法保证后续实验要求，太多会使裂解提取步骤不够充分。 3、 菌体裂解 (1)洗涤菌体 用1ml STE重悬洗涤菌体，离心，12000g离心30秒，收集菌体。重复用STE漂洗菌体。 注:洗涤的目的在于除去培养基中菌株细胞壁成分，以免其抑 21 制限制性内切酶的活性。 (2)加入溶液I——使菌体充分裂解 菌体沉淀重悬浮于200μl溶液?中，剧烈振荡，使菌体充分裂解。 (3)加入溶液?——变性DNA 加入新配制的溶液?300μl，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管6-8次，此时溶液变澄清;冰浴5分钟。 溶液II 1ml的配制:20ul 10N NaOH + 100ul 10%SDS + 880ul 水 注:1)混匀操作要快，以免局部碱浓度过高; 2)混匀操作要温和，不能剧烈震荡，以免损伤质粒DNA; 3)应确保整个离心管的内表面均与溶液?接触并混匀内容物(千万不要振荡)。 (4)加入溶液?——质粒DNA复性 加入300μl预冷的溶液?，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管6-8次，此时管内出现白色絮状沉淀。 冰浴中10分钟。4?下12000g离心5-10分钟。 注:混匀操作也要温和和迅速。 4、分离纯化质粒DNA (1)收集上清 取上清600μl于新离心管中。 (2)RNase酶消化 加入10μl 10mg/ml RNase酶溶液，37?消化RNA 20分钟。 22 (3)酚-氯仿抽提DNA 分别加入等体积的酚和氯仿(各300μl)，在涡旋混合器上振荡几秒。 12000rpm 4?离心10分钟，取上清。 注:此步骤用于除去体系中的蛋白质。 (4)沉淀质粒 加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置于-20度放置30分钟; 12000rpm 4?离心30分钟，弃上清。 注:沉淀DNA可使用2倍体积的无水乙醇或等体积的异丙醇。 (5)洗涤质粒 加入600μl 75,乙醇，洗涤沉淀，12000rpm 4?离心10分钟，弃上清，室温晾干。 (6)溶解质粒 沉淀用10μl ddH2O溶解，进行酶切鉴定或,20?保存备用。 5、酶切反应: (1)酶切体系 20ul 在PCR小管中加入:质粒DNA 10μl，10×Buffe(M)r 2μl，EcoRI 1μl，Hind? 1μl，灭菌水6μl。 混匀离心。 注:1)不同的限制性内切酶对应不同的酶反应缓冲液;使用双 23 酶切时，如果两个酶所要求的缓冲液不同，可以?先做单酶切 ，凝胶回收后做另一酶切，但此种方法损失的样品较多;?通 过查阅说明书，选择两个酶都合适的缓冲体系(两种酶在其中 都能高效运作)，本实验即属于此类。 2)酶切体系，中酶的量不超过体系的十分之一，吸取时注 意避免枪头外壁附着过多酶量。 (2)酶切反应 37?保温过夜。 (3)电泳检测 跑1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果。 6、测序及同源性分析 PCR筛选及酶切鉴定所得的阳性克隆子一般交由公司测序，测序结果提交GenBank进行同 源性分析。 同源性分析如果显示测序结果与我们在设计PCR引物时所用的目的序列相同或有较高的同源性，才能真正证明我们一系列的工作的正确:从提取核酸，到PCR反应，纯化，克隆等。 24