人α-防御素基因的克隆及其在293T细胞中表达的临床意义

人α-防御素基因的克隆及其在293T细胞中表达的临床意义 人α-防御素基因的克隆及其在293T细胞中 表达的临床意义 山东医药2007年第47卷第23期 人一防御素基因的克隆及其在293T细胞中 表达的临床意义 王峰h,黄璐圆 (1暨南大学药学院基因组药物研究所,广东广州510632; 2中国科学院广州生物医药与健康研究院分子医学中心) [摘要]目的克隆人一防御素(—HNP)基因,构建重组真核表达质粒pCG—HNP并检测其在293T细胞中的 表达.方法提取人PBMC细胞的RNA,以其为模板用RT—PCR技术克隆人—HNP的eDNA,并将其插入质粒pCG 中构建真核表达载体.测序证实后,将重组质粒用脂质体法转染293T细胞,用蛋白质免疫印迹法(Western)检测 目的蛋白分子的表达.结果测序证实克隆的人.HNP阅读框正确完整,PCR鉴定和酶切鉴定证实插入方向正 确,免疫印迹结果显示重组质粒能够在293T细胞中表达HNP—GFP—Flag融合蛋白.结论?HNP基因成功克隆; 其在293T细胞中的表达可为进一步研究其抗HIV活性奠定基础. [关键词】防御素;293T细胞;真核表达 [中图分类号]Q78[文献标识码]A[文章编号]1002-266X(2007)23-0010-03 Cloningofhumanoc-defensingeneanditsexpressionin293Tcell WANGn".HUANGLu—yuan (1InstituteofGenomicMedicine,CollegeofPharmacy,JinanUniversity,Guangzhou51063 2,P.R.China) Abstract:[Objective]Toclonethehuman一HNPandtoconstructtherecombinanteukaryotieexpressionplasmid pCG?HNPforexpressionin293Tcells.Method:UsinghumanPBMCRNAastemplate,weclonedtheORFofhuman一 HNPbyRT— PER.TheORFwasinsertedintoplasmidpCGforconstructionoftheeukaryotieexpressionvector,which subsequentlywastransactedinto293Tcellsaftersequencingbylipidtransfeetionmethod.TheexpressionofHNP—GFP— Flagin293Tcellswasdetectedbywesternblotting.[Results]SequencingconfirmedthattheORFofthehuman仅一HNP wasintactandright.PCRidentificationandrestrictiveenzymedigestionprovedthattheORFwasinsertedintopCGin correctdirection.DeterminationwithFlagantibodybywesternblotting,anantieipativebandbythecelllysateWas displayed,butnotincontro1.[Conclusion]Thehuman?HNPhasbeenclonedsuccessfullyanditWasfoundtobe expressedin293Tcells. Keywords:defensin;293Tcells;eukaryotieexpression 防御素是天然免疫的重要介质.哺乳动物防御 素分为3个亚家族,即,B和0防御素….人防 御素主要在中性粒细胞,小肠帕内特(Paneth)细胞 成熟前的分化过程合成,贮存于胞质颗粒中,于病原 微生物感染时释放.产生于人中性粒细胞的防御 素被命名为Ol—HNP.近年研究表明,防御素具有抗 HIV活性,但机制不清..2006年l2月,我们克 隆了人一H?P基因,构建其真核表达载体并在293T 细胞中实现表达,旨在为进一步研究其作用机制奠 定基础. [基金项目]广东省自然科学基金资助项目(06300563). '通讯作者 10 1材料 1.1试剂总RNA提取试剂Trizol,SuperScriptIII 反转录酶(Invitrogen公司),限制性内切酶,RNA酶 抑制剂,T连接酶,高保真聚合酶Pyrobest,dNTP (Takara公司).PCR纯化试剂盒,DEPC(鼎国公 司),引物合成于上海生工. 1.2引物设计采用引物设计软件Pfime~.0,根 据Ol—HNP基因序列(GenBank登录号NM一004084) 设计两对引物(P和P:).正向P:5一 ACCATGAGGACCCTCGCCATCC1Tr-3;反向P,:5一 GCAGCAGAATGCCCAGAGTCTT一3;T7Primer:5一 TAATACGACTCACTATAGGGAGA一3. 2实验方法 山东医药2007年第47卷第23期 2.1一cDNA的克隆和表达载体的构建? cDNA链合成:提取正常人外周血单核细胞中的总 RNA,取RNA模板5g,引物oligo(dT)18Primer (0.5g/m1)1l,加DEPC处理水至12l,然后 65?反应15min,冰上终止反应后加5×buffer4 l,Rnasin(20U/)1l,10mMdNTP2l,37oC 反应5min,随后加SuperScriptm1l,50oC反应6O min.反应所得cDNA保存于一2O?.?一删P基 因扩增:以获得的cDNA为模板,P/P为引物,PCR 扩增目的片断.PCR反应体系为:10×buffer5l, 10mMdNTP1l,10MP12l,10MP22l, PyrobestDNA聚合酶1l,加水至5Ol.PCR反应 条件如下:94oC变性3min后,进行3O个循环,程序 为:95?变性30s,55oC退火30s和72?延伸3O s.?PcR产物回收及连接反应:从琼脂糖凝胶上切 下含目的片断的电泳条带,按试剂盒使用说明书进 行PCR产物回收.取回收的PCR产物4l,pCG/ EcoRV载体1l,5×buffer2l,TaDNA连接酶 1,加水至1Ol,16?过夜.?重组质粒转化及 鉴定:用CaC1法转化DH5a感受态宿主菌,涂布于 含有Amp的LB培养基平板,37?培养过夜.挑取 菌落进行菌落PCR鉴定,取阳性克隆提取质粒进行 Hindm和XbaI双酶切鉴定. 2.2基因转染及表达检测按照Lipofectamine转 染试剂盒的操作说明转染293T细胞.用空载质粒 作阴性对照.基因表达检测采用蛋白质免疫印迹法 (Western):于转染后36h用RIPA裂解细胞并收集 于1.5ml离心管中,加入上样缓冲液后以超声波破 碎,并在沸水中加热3min,离心取上清经聚丙烯酰 胺凝胶电泳后转PVDF膜.将PVDF膜放人封闭液 (用TBS配制的5%牛奶)中37?封闭1h.加 1:5000稀释的抗nag抗体(一抗),37?孵育1h, 加入碱性磷酸酶标记的抗鼠抗体IgG(二抗),37? 孵育1h,室温在BCIP和NBT显色液中显色. 3结果 3.1PCR产物及重组质粒酶切鉴定以单链cDNA 为模板,用Pyrobest高保真酶以一剧VP基因特异引物 P,和P进行PCR扩增,得到大小为280bp左右的特 异扩增片段,割胶回收后平端连接到pCG/EcoRV载 体上,转化大肠杆菌,挑取菌落进行菌落PCR初步鉴 定,对鉴定为阳性且正确插入方向的质粒进行酶切鉴 定.结果T7Primer和P引物组合扩增得到的350bp 左右片断为插人大小和方向正确的克隆(图1左).对 正确插入方向的克隆提取质粒进行Hindm和XbaI双 酶切鉴定显示,切出的外源片断大小与预期一致(图1 右),送英骏公司测序. N"一 . 一7891()ii12蕾?图1重组质粒的PCR鉴定(左)和酶切鉴定(右) 3.2测序结果用BLAST搜索GenBank数据库对 测序所得序列进行同源性比较,发现它与—HNP基 因序列(NM一004084)基本一致,编码氨基酸相同. 用DNASIS(2.5)软件分析其核苷酸及其推导的氨基 酸序列,结果见图2. MRTLAILAAILL lATGAGGACCCTCGCCATCCTTGCTGCCATrCTCCTG IVALQAQAEPLQA 37GTGGCCCTGCAGGCCCAGGCTGAGCCACTCCAGGCA RADEvAAAPEQI 73AGAGCTGATGAGGTTGCToCAGCCCCGGAGCAGATT AADIPEVVVSLA lO9GCAGCGGACATCCCAGAAGTGGTTGTTT0C('rGCA WDESLAPl(HPGS l45丁GGGACGAAAGCTTGGCTCCAAAGCATCCAGGCTCA RKNMACYCRIPA l8lAGGAAAAACATGGCC丁GCTATTGCAGAATACCAGCG CIAGERRYGTCI !I7TGCATTGCAGGAGAACGTCGCTATGGAACCTGCA丁.c YQGRLWAFCC 253TACCAGGGAAGACTCTGGGCATTCTGCTGCTGA 2 图2P读码框的核苷酸序列及 其编码的氨基酸序列 3.3转染基因表达检测用荧光显微镜检测转染后 的细胞,发现有绿色亮点,提示转染重组质粒的293T 细胞表达融合蛋白,蛋白大小和预期一致,而转染空 载体的293T细胞未表达融合蛋白,说明载体构建成 功,且构建的新载体可在293T细胞中表达. 4讨论 以往人们对HIV的感染防治集中在获得性免 疫上;近年来先天性免疫在控制HIV感染中的重要 作用越来越受到关注.在机体内产生HIV抗体之 前,HIV病毒感染的早期阶段,CDsT细胞能产生一 些具有抗病毒活性的可溶性细胞因子,即CD.抗病 毒因子(CAF),这些因子的产生与HIV感染者病程 的延缓密切相关.起初人们发现CAF中的CC类趋 化因子能竞争性的与HIV进入细胞的共受体CCR5 结合,因而具有抗HIV病毒活性,后来Zhang用蛋白 质芯片技术发现CAF的抗病毒活性主要归功于 CAF中的防御素. 11 最近研究表明,防御素不同于CAF,在CDT 细胞中检测到Ot防御素是因为CDT细胞能从与其 共培养的细胞中吸收Ot防御素-5].Ot防御素既可 通过直接使病毒失活发挥抑制HIV复制的作用,也 可通过影响靶细胞间接发挥作用.无血清时防御 素可直接作用于病毒,但这种作用会被血清阻断;有 血清时防御素可作用于靶细胞,抑制病毒复制. Mackewicz的研究表明,从人嗜中性粒细胞纯化的 防御素可通过直接使病毒失活和作用CD细胞来抑 制病毒感染,有效剂量在200g/ml,但是伴随细胞 毒性.而Chang的研究表明,5g/ml的重组 防御素可抑制病毒感染且无细胞毒性J.本研究成 功克隆O/一删P基因,构建真核表达质粒pCG一删P, 转染293T细胞并进行了表达,此为获得基因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 产 品及进一步研究O/一HNP抗HIV感染作用机制奠定 ? 经验交流? 山东医药2007年第47卷第23期 了基础. [参考文献] [1]李霞,王义琴,萨其拉,等.防御素基因工程研究进展[J].中 国生物工程杂志,2003,23(3):6一lO. [2]ZhangL,YuW,HeT,eta1.Contributionofhumanalpha—defensin l,2,and3totheanti—HIV—lactivityofCD8antiviralfactor[J]. Science,2002,298(5595):995—1000. [3]ChangTL,VargasJ,DelPortilloA,eta1.Dualroleofalpha— defensin—linanti—HIV—linnateimmunity[J].JClinInvest,2005, l15(3):765-773. [4]ChangTL,FrancoisF,MosianA,eta1.CAF—mediatedHIVtypel transcriptionalinhibitionisdistinctfromalpha—defensin—lHIV inhibition[J].JVirol,2003,77(12):6777-6784. [5]MackewiczC,YuanJ,TranP,eta1.Alpha—defensinscallhave anti—HIVactivitybutarenotCD8cellanti—HIVfactors[J].AIDS, 2003,17(14):23-32. (收稿日期:2007-04—23) 免疫球蛋白治疗新生儿ABO溶血病22例 王凤莲.闵月红 (1益都中心医院,山东青州262500;2青州市 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 生育服务站) 1997年1月一2005年1月,我们采用免疫球蛋白(IVIG) 治疗新生儿ABO溶血病22例,效果满意.现 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 如下. 资料与方法:同期收治的45例ABO溶血病新生儿,男 28例,女17例;人院日龄<12h25例,12—48h16例, >48h4例.黄疸出现时问为生后24h33例,48h12例;A 型血29例,B型血16例.将45例患儿随机分为观察组22 例和对照组23例.其一般资料具有可比性.两组人院后均 立即给予光疗.口服肝酶诱导剂苯巴比妥,尼可刹米,静滴白 蛋白1g/kg.在此基础上观察组予IVIG500—800mg/(kg ? d)静滴,连用3d.观察两组黄疸消退时间,光疗时间及治 疗前后血清总胆红素,血红蛋白含量.数据采用x?s表示, 采用SPSS11.0统计学软件进行t检验. 结果;观察组黄疸消退时间和光疗时间分别为(6.00 2.10)h,(53.01?18.90)h,对照组分别为(4.38?1.85)h, (4o.50?13.71)h,两组比较P均<0.05.两组各项观察指标 比较见表1.观察组均治愈出院:对照组11例并发核黄疸.随 访0.5—1a,8例智力发育迟缓,1例脑性瘫痪,2例听力低下. 讨论:ABO溶血病是母婴血型不合,母体免疫抗体IsG 通过胎盘进入胎儿血循环而引起的同族免疫反应所致.溶 血通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)作用而引起, 其效应细胞属大颗粒淋巴细胞中的K(杀伤)细胞,K细胞的 Fc.IgG受体与致敏的红细胞IsG抗体可导致红细胞死亡及溶 12 血.目前治疗新生儿溶血病多采用光疗,肝酶诱导剂口服, 表1两组治疗前后相关指标变化(i?) 注:与对照组比较,'P<0.05,一P<0.01 白蛋白输注等方法,严重病例采用换血疗法,但换血疗法操 作程序复杂,无菌操作 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 高. 本文观察组光疗时间和黄疸消退时间均明显低于对照 组,治疗后血清总胆红素浓度均显着低于对照组,血红蛋白 浓度显着高于对照组,提示IVIG可快速控制溶血,降低血清 胆红素水平,此为防治核黄疸的关键,IVIG的作用机制为广 泛与患儿网状内皮系统巨噬细胞上的Fc受体结合而起到封 闭作用,从而阻断患儿红细胞破坏;使新生儿血浆中的IgG 迅速升高,加快血型抗体在体内的清除. (收稿日期:2007-05-23)