乙酰胆碱酯酶活性中心的抗原性

乙酰胆碱酯酶活性中心的抗原性 一 滨州医学院 1996年第19卷第4期 JOURNALOFBINZHOUMEDICALCOLLEGE VD-.19No.41996 乙酰胆碱酯酶活性中心的抗原性' 欠lt(滨州医学院实验医学研究中心,滨州市256603军事医学科学院毒物药物研究所) 内容摘要以酶联免疫吸附试验及免疫亲和层析方法时AChE活性中心的抗原性进行 研究结果显示,AChE活性中心的阴离子部位参与构象型决定簇的构成,而活性中心酯解部 位丝氨酸在完整AChE可能不参与构成抗原决定簇. 关键词塾照生壁睦;蓬竺生生 乙酰胆碱酯酶(ACHE,EC31.1.7)是神经 系统重要成分之一,其催化神经递质乙酰胆碱的 水解,维持神经系统功能的稳定用单克隆抗体技 术研究AChE的功能区域及分子结构对揭示其结 构与功能的关系具有十分重要的意义.研究表明. AChE活性中心可能参与AChE单克隆抗体3F3 识别的抗原决定.作者对AChE活性中心的 抗原性进行了研究 1仪器与材料 EIISA测定酶联板(天津有机玻璃制品厂); 微量多道扫描仪(美国FolwLaboratories公司); ATTO小型紫外监测仪(日本ATTO公司);UV 250紫外可见分光光度计(日本日立公司);高速 冷冻离心机(日本岛津公司)fCNBr活化 Sepharose一4B(PharmaciaLKB公司)}邻苯=胺 (OPD).Merck公司I辣根过氧化物酶标羊抗鼠 IgG,军事医学科学院微生物流行病研究所; AChE,中国丁氏双鳍电鳐电器官纯ff还原并 烷基化AChE(RA—ACHE).纯化AChE还原烷基 化得一I热处理AChE(HACHE);AChE,IO0~C加 热5min,经测定活性完全丧失;Soman—AChE?以 包被液配制I×1o-M棱曼溶液1;500稀释 AChE,37?,30rain得}PAM—AChE以包被液配 制1×10M氯磷定(PAM)溶液1500稀释 AChE得;3F3单克隆抗体以纯化的AChE为抗 原制备".其他试剂为国产分析纯. 2方法与结果 21单克隆抗体sl免疫亲和凝胶的台成取 纯化的3F333mlfc.77mg/m1).对偶联缓冲液 ?国家自然科学基金资助课题 ?3l8? (0.1MNaHCq一0.5MNaCIpH8.0)透析24h. 取CNBr活化的Sepharose一4B3g,加1?0mMHCI (pH.5)30m[浸泡15min,以G1沙芯漏斗抽滤, 以1.0mMHCI冲洗5次;抽千后加偶联缓冲液 30ml,迅速搅拌并抽千,迅速加入上述透析好的 3F3并混合搅拌,在室温下反应2,5h,抽滤,取出 凝胶,加入20ml乙醇胺(偶联缓冲液配制),在室 温中搅拌2h,抽滤.用偶联缓冲液,0.1M乙酸钠 盐一0.tSMNaCt缓冲液(pH4.o)交替冲洗5次, 再以0.01M磷酸缓冲液一0,lM:qaCt(pH8,0) 005MN-O冲洗,以紫并丹光光度计测 定3F3溶液偶联前后及洗涤液e变他.计算偶 联率为63. 22天然及热处理AChE的免疫亲和层析将 天然及热处理AChE分别上3F3免疫亲和层析 柱.以0.05MNH'HCq洗涤非特异性吸附的杂 蛋白后,再用pH11的0.05MNHs?0洗脱特 异性吸附的蛋白时,均出现洗脱峰(图1),说明天 然AChE,热处理AChE均能与3F3结合. 2.3天然及变性AChE与单克隆抗体3F3的抗 原抗体反应取天然及变性AChE(1500),热 处理AChE(1500)及RAACHE(1:200)分别 包被96孔滴定板,以单克隆抗体3F3(1:5000) 为第一抗体.以辣根过氧化物酶标羊抗鼠I窖G为 第二抗体,进行ElISA测定结果表明.天然及 热处理AChE均有较强的抗原性.而RAAChE 无抗原活性表现(见表1) t.4药物煦毒物修饰的AChE与3F3的抗原抗 体厦应以SomanAChE(1:500)及PAM— AChE(It500)包被96孔滂定板,以.3F3为第一 抗体(1:5000),如上法进行ELISA测定结果表 明,PAM-AChE未显示抗原活性,SomAn-AChE 显示明显的抗原性(见表2). A日 图1天然和热变性AChE的免疫隶和层析 A:天然AChEB热变性AChE 表13F3与AChE,H—AchE夏 RA-AChE的l抗原抗体反应 比 AChE机797士机0770.O】7士0.O】6 H—AChE0.929士m】120028士0022 RA—AChE0.960士0.0120025士0.012 ;士,n=9 表2药柏和,或毒抽修饰AChE抗原性 AC nativeAChE0362士0.0920.006士0.006 PAMAChE0014士0们60.006士0.006 Soman--ACHE0.353?00430.003士0.003 ,.------------------------------------------------------------------------------------------------------ --一 ?,n=3 3讨论 AChE酶蛋白分子表面的活性中心有两个能 与乙酰胆碱结合的部位.即带负电荷的阴离子部 位和酯解部位.酯解部位含有一个由丝氨酸的羟 基构成的酸性作用点和一个由组氨酸眯唑环构成 的碱性作用点}阴离于部位由芳香氨基酸残基的 电子起反应与乙酰胆碱结台,此结合都位含有 网肽Gly—Ser—x—Phe,x在电鳐为Phe,果蝇为 TrpAChE单克隆抗体3F3能够抑制AChE的活 . 说明3F3识别的抗原决定壤与AChE量 中心具有密切的关系亲和善斫酊热处理AChE 仍可与3F3结合;ELISA拟定时3F3亦能与热处 理AChE发生抗原抗体反应枷iRA:AChE不能 与3F3发生抗原抗体反应.说明3F3识的抗原 决定簇是由AChE活性中心参与构成(但不只是 活性中心,也不包括活性中心的全部)的构象型决 定簇. 蛋白质变性后构象发生变化,这种构象的变 化有两种情况:一是肚髓的完垒伸曩一是肽链 的不完全伸展.即有一部分有序结构被保留?加热 与无机盐导致的变性经常如此AChE加热变性, 使其活性中心的整体构象发生变化周而丧失活 性,但参与构成3F3识别的决定簇的部分得到保 留,因而热变性AChE保留了与3F3发生抗原抗 体反应的能力. .PAM能与AChE活性中心的阴离子部位结 舍.而Soman能与AChE活性中心的丝氨酸羟基 - 结合..PAM-AChE不表现抗原性.可能因PAM 与阴离子部位结台后,占据空间大,影响3F3与 AChE的结合.SocRan-AChE具有抗原活性,可能 是AChE的丝氨酸不参与3F3识别的抗原央定簇 的构成,或Soman分子小不影响3F3与AChE的 结台. 综上所述.AChE活性中心阴离子部位参与 构象型抗原决定簇的构成.而活性中心醇解都位 丝氨酸在完整AChE可能不参与构成抗原决定 簇.AChE活性中心阴离子部位不但其有与底物 季铵陌离子头结合而催化其分解的能力,而且具 有诱导抗体生成的功能. 参考文献 [1]Wang.IB.LiFZ.FuFi'l:.eta1.Electsofpurifiedanti? acetyJch.linestm-~semonoclonnlantibodiesOntheen- activity.ChineseIP~rmaco]Toxlco1.1989I9l 225 [2]孙曼霁,高天拣.邢志勇.等.中国丁氏双培电蟠己酰 招碱酯酶的材备性亲和层析.生物化学杂志,1985I1 :47 [司LeeSL,CampSI.Tsy]orP.ch删rl柏1【.nofIthy— drophohic,dimer[eformofacetylcholinesterasefrom TorpedoJBiolChem,1982I257:12302 [4:辛颜彬,阎国珍,僚品芳,等.抗己酰胆碱醑酶单克隆 抗体的产生.中国药理学与毒理学杂志,1989;3:68 [57Do~orBPtCampStGentD-MK,eta1.AmjgLcand ruc1uHldifferencesinthecatalyticsubunEts.fthe matecularformsacety]cho]in~stcrase.PrNlSci S^,1993l80:5787 .每?吁缟着蚤臼蜃亿学.j:京;斟学出舡社.1984- t收稿日期:1995一10" ?319?