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PMA

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王帅 徐进 许景升

Summary 本文将叠氮溴化丙锭（PMA）与荧光实时定量PCR技术相结合，建立了一种适于青枯菌不同小种菌株活细胞精准、快速检测的PMA-qPCR方法。通过单因素变化试验对PMA预处理反应体系中的各参数进行优化，确立了PMA终浓度为15 ng/μL，黑暗孵育时间为10 min，曝光时间为5 min的PMA预处理体系。试验结果表明，当活菌比例大于10%，PMA-qPCR的测定结果均在理论活菌数相对应的95%置信区间内。检测灵敏度测试结果显示，该方法适用于活菌数在5.0×10.2～5.0×10.8 cfu/mL范围内菌悬液的检测。本文建立的PMA-qPCR方法可在一定范围内有效去除青枯菌死菌的干扰，定量检测出活菌数量，研究结果可为植物细菌性青枯病的流行规律研究提供新的技术支撑。

Key PMA-qPCR； 青枯菌； 活菌检测

： S 435.32

： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017483

Abstract By combining propidium monoazide （PMA） with fluorogenic （TaqMan） PCR， we developed a novel method for specific detection of viable cells ofRalstonia solanacearum at species level. We optimized various parameters of PMA by single factor change test to establish the system of PMA pre-treatment. The optimal conditions for PMA-qPCR were： a final concentration of PMA of 15 ng/ mL， a dark incubation time of 10 min， and an exposure time of 5 min. The test results showed that， within the range of 50×10.2-5.0×10.8 cfu/mL， when the proportion of viable bacteria was greater than 10%， the results of PMA-qPCR were almost identical with the theoretical values. The method could effectively remove the interference of the dead cells ofR.solanacearum and quantitatively detect the number of viable cells， thereby providing a new technical support for the research of epidemiology of bacterial wilt caused byR.solanacearum.

Key words PMA-qPCR； Ralstonia solanacearum； viable cell detection

植物细菌性青枯病（bacterial wilt of plants）是由茄科雷尔氏菌Ralstonia solanacearum Yabuuchi（简称青枯菌）引起的一种世界性重大病害。青枯菌菌系复杂，寄主范围广泛，可侵染包括马铃薯、生姜、番茄、辣椒等重要经济作物在内的54科450余种植物[1-2]。青枯病是热带、亚热带以及温带某些地区农业生产的重要限制因子，且近几十年来，该病逐渐向高纬度、冷凉区域扩散蔓延[3]。迄今为止，青枯病的有效防控仍是难以突破的世界性瓶颈问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 。建立精确、灵敏、高效的早期诊断技术，是有效阻断青枯病传播扩散，制定科学防控策略的基石。2001年，Grey等首次报道了铜制剂可诱导青枯菌进入活的非可培养（viable but nonculturable， VBNC）状态[4]，VBNC状态的青枯菌失去了在传统培养基上生长繁殖的能力，因此采用常规平板培养方法会造成假阴性检测结果[4]；而常规的PCR检测技术不仅能扩增活菌细胞DNA，也会扩增死菌细胞DNA以及游离状态的DNA分子，致使假阳性结果的产生。目前已报道的青枯菌活菌检测主要基于膜完整性的检测方法和基于代谢活性的检测方法。基于膜完整性的检测方法主要分为两类，一类是用SYTO9和碘化丙啶（PI）对青枯菌染色后结合荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜或流式细胞仪进行检测[4-9]；另一类是用叠氮溴化丙锭（propidium monoazide， PMA）或叠氮溴化乙锭（ethidium monoazide bromide， EMA）预处理，再通过PCR或qPCR进行检测[10-12]。这两类检测方法是目前青枯菌VBNC研究中常用的方法。基于代谢活性的检测较为经典的方法有CTC法和DVC法[4-5，13]。本研究以VBNC状态青枯菌的定量检测为出发点，利用PMA对活/死细胞具有选择性的特性，将PMA与荧光定量PCR相结合用于青枯菌活菌检测。对PMA作用于青枯菌的最佳浓度、黑暗孵育时间以及曝光时间进行摸索。本文针对样品中活的以及VBNC状态的青枯菌，旨在建立一种快速、灵敏、特异性强且可定量检测青枯菌的方法，藉此为带菌植物繁殖材料的检测与青枯病防治效果评价提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

番茄品种‘中杂106号购自北京中农良种公司；供试的青枯菌Z-Aq-1菌株由笔者实验室分离、保存。

叠氮溴化丙锭（PMA）购自美国Biotium公司；Probe qPCR Mix购自TaKaRa公司；650 W卤钨灯购自德國Osram公司；ABI 7500型荧光定量PCR仪购自美国Applied Biosystem公司； SPECORD40紫外分光光度计购自德国Analytik Jena AG公司；INFORS Ecotron 振荡培养箱购自瑞士INFORS公司；Memmert IN55培养箱购自德国美尔特公司。

NB （nutrient broth）培养基：葡萄糖10 g，多聚蛋白胨5 g，牛肉浸膏3 g，酵母提取物0.5 g，用蒸馏水定容到1 000 mL，调节pH=7.0，121℃灭菌20 min。固体培养基加1.8%琼脂。改良的选择性NA培养基（mNA）：NB 培养基中添加多黏菌素（polymixin-B-sulphate）至终浓度20 mg/mL，杆菌肽（bacitracin）至终浓度5 mg/mL，氯霉素（chloramphenicol）至终浓度1 mg/mL，青霉素（penicillin-G）至终浓度5 mg/mL，TZC存储液[1%红四氮唑（C19H15ClN4）115℃灭菌7～8 min]至终浓度50 mg/L。抗生素在培养基45～50℃时加入。

1.2 试验方法

1.2.1 菌悬液制备

使用接種环蘸取室温下保存在无菌水中的Z-Aq-1菌悬液， 于mNA培养基上划线。 28℃条件下培养48～72 h后， 挑取典型的青枯菌野生型菌落， 经PCR验证后转至普通NA培养平板。28℃条件下培养48～72 h后， 挑取菌脓于NB液中28℃振荡培养至A600=0.8～1.0（菌悬液浓度为1.0×10.9～3.0×10.9 cfu/mL）。取1 mL上述菌液至1.5 mL离心管中， 12 000 r/min， 离心5 min，弃上清，等体积无菌水反复洗涤3次后，悬浮于1 mL无菌水中， 100℃水浴30 min， 获得热灭活的死菌细胞悬浮液。

1.2.2 PMA质量浓度的优化

称取1 mg PMA溶解于200 μL 20%二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中，得到质量浓度为5 μg/μL的贮存液， 于-20℃保存。使用前将贮存液稀释为0.5 μg/μL的工作液。将不同体积的PMA工作液添加到500 μL浓度为10.9 cfu/mL的活菌菌悬液中， 充分混匀，获得PMA 最终质量浓度分别为0、5、10、15 和20 ng/μL；同样方法对热灭杀的死亡菌体悬浮液进行处理。将全部处理的菌悬液置于黑暗处孵育10 min， 随后，开盖向上置于冰上， 在距离650 W卤钨灯15 cm处均匀曝光5 min， 曝光结束后， 取4 μL 菌体悬浮液作为模板分别进行荧光定量PCR。通过7500 Software V 2.3 采集循环阈值（cycle threshold，Ct） 。每次试验设5个平行样，每个样品3个重复，每组试验重复3次。

1.2.3 PMA预处理黑暗孵育时间的优化

分别添加PMA工作液于500 μL 10.9 cfu/mL活菌菌悬液和热灭活死菌菌悬液中，充分混匀，获得PMA最终质量浓度为15 ng/μL，随后置于黑暗处孵育。设置孵育时间为0、2、5、10 和15 min，其后的操作步骤同1.2.2。每次试验设5个平行样，每个样品3个重复，每组试验重复3次。

1.2.4 PMA预处理最优曝光时间的选择

分别添加PMA工作液于500 μL 10.9 cfu/mL活菌菌悬液和热灭活死菌菌悬液中，充分混匀，获得PMA最终质量浓度为15 ng/μL，置于黑暗处孵育10 min后，开盖向上置于冰上，在距离650 W卤钨灯15 cm处分别均匀曝光0、2、5、10 和15 min，其后操作步骤同1.2.2。每次试验设5个平行样，每个样品3个重复，每组试验重复3次。

1.2.5 荧光PCR检测体系

利用ABI 7500 Real-Time PCR仪进行检测。参考Weller等[14]的报道合成引物和探针。上游引物RS-I-F：5′-GCATGCCTTACACATGCAAGTC-3′；下游引物RS-II-R：5′-GGCACGTTCCGATGTATTACTCA-3′。Taqman探针RS-Pb的5和3端分别以荧光报告基团（FAM）和淬灭基团（TAMRA）进行标记 （5′-FAM-AGCTTGCTACCTGCCGGCGAGTG-TAMRA-3′）。引物和探针由上海生工生物工程有限公司合成。反应体系（50 μL）为：Probe qPCR Mix（2×）25 μL， 上游引物（10 μmol/L） 1 μL，下游引物 （10 μmol/L） 1 μL，探针2 μL，ROX DyeⅡ （50×）0.5 μL，模板4 μL，超纯水16.5 μL。反应条件为：95℃预变性30 s；95℃ 5 s，60℃ 1 min （收集荧光信号），共40个循环。

1.2.6 PMA-qPCR检测不同比例的活菌

将热灭活死菌与同浓度活菌按不同比例混合以制得活菌占比分别为0、10%、20%、50%、80%、90%、100%的活菌/死菌混合液，待测。

另取1 mL处于对数期的新鲜活菌（A600=0.8～1.2）于1.5 mL离心管中，12 000 r/min，离心5 min，弃上清，等体积无菌水反复洗涤3次后，悬浮于1 mL无菌水中，10倍梯度进行系列稀释，分别得到稀释10.0、10.1、10.2、10.3、10.4倍的菌悬液，作为建立标准曲线的样品液。

吸取500 μL待测活菌/死菌混合液和标准样品液按照优化条件进行PMA预处理。随后取4 μL菌悬液作为模板进行荧光定量PCR。同时，分别取100 μL不同稀释倍数的样品液涂布平板，用以计算样品液中的活菌数。根据荧光定量PCR后7500 Software V 2.3 采集的不同比例活菌菌悬液的Ct值，结合标准曲线，计算得到不同比例活菌/死菌混合液中的活菌数。每次试验设3个平行样，每组试验重复3次。

1.2.7 PMA-qPCR灵敏度检测

浓度为1.0×10.9 cfu/mL的活菌及热灭活死菌菌悬液同体积混合后，依次进行10倍梯度稀释，分别获得浓度为5.0×10.8、5.0×10.7、5.0×10.6、5.0×10.5、5.0×10.4、5.0×10.3、5.0×10.2、5.0×10.1、5.0×10.0cfu/mL的待测菌悬液。同时，如1.2.6所述建立标准曲线。通过7500 Software V 2.3 采集不同处理菌悬液的Ct值，并根据标准曲线计算得到不同混合液中的活菌数。每次试验设3个平行样，每组试验重复3次。

2 结果与 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析

2.1 PMA预处理反应体系优化

2.1.1 PMA质量浓度的优化

使用PMA对青枯菌活菌进行预处理时，随着PMA处理浓度的增加，活菌扩增的Ct值无显著变化（图1），这是因为活菌的细胞膜完整，而PMA不能透过完整的细胞膜与细胞内的DNA分子结合。而使用PMA对热灭活死菌进行预处理时，当PMA的浓度在0～15 ng/μL时，随着PMA处理浓度的升高，扩增的Ct值显著增加，这是因为低浓度的PMA不能完全与死菌细胞的DNA结合，从而不能最大限度地抑制死菌细胞的DNA扩增。当PMA浓度为20 ng/μL时与15 ng/μL无显著差异， 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 PMA浓度为15 ng/μL时已可最大限度地抑制死菌细胞DNA的扩增。因此，选择15 ng/μL作为PMA预处理的最优浓度。

2.1.2 PMA预处理黑暗孵育时间的优化

黑暗孵育时间优化试验表明，随着黑暗孵育时间的延长，活菌扩增的Ct值无显著变化（图2），这是因为PMA不能进入到活细胞内与DNA分子结合，而在随后的曝光处理过程中被光解，并未对后续的荧光定量PCR产生影响。而使用PMA对热灭活死菌进行预处理时，当黑暗孵育时间小于10 min时，随着孵育时间的延长，扩增的Ct值显著增加，这是因为在黑暗孵育过程中，随着时间的延长，PMA与热致死细胞DNA的交联结合率升高，从而对死细胞DNA扩增的抑制作用增强，而黑暗孵育10 min与15 min的Ct值无显著差异，说明黑暗孵育10 min可使得PMA与热致死细胞的DNA最大程度地结合，从而有效避免死细胞DNA的扩增。因此，选择10 min作为PMA预处理的最优黑暗孵育时间。

2.1.3 PMA预处理最优曝光时间的选择

由图3可知，使用PMA对活菌进行预处理时，当曝光时间小于5 min时，随着曝光时间的延长，Ct值逐渐降低，这是因为曝光时间过短，不能使残留的PMA完全光解，从而对后续的荧光定量PCR产生抑制作用，而曝光时间大于5 min时，各处理活菌的Ct值无显著差异，说明曝光时间大于5 min，可使残留的PMA完全光解从而消除残留PMA对后续qPCR的影响。使用PMA对热灭活死菌进行预处理时，当曝光时间小于5 min时，随着曝光时间的延长，Ct值逐渐增加，这是因为曝光时间增加，残留PMA的光解率升高，对DNA扩增的抑制作用减弱，而曝光时间大于5 min时，各处理死菌的Ct值无显著差异，进一步说明曝光5 min足以使残留的PMA完全光解。因此，选择5 min作为PMA预处理的最优曝光时间。

2.2 PMA-qPCR检测不同比例的活菌

将处于对数期的新鲜活菌悬液（浓度约为10.9 cfu/mL），10倍梯度稀释，得到活菌浓度梯度为10.5 ～10.9 cfu/mL的活菌菌悬液，再进行PMA-qPCR，活菌细胞数量与Ct的相关性如图4所示。由Ct值與不同活菌浓度产生的线性回归表明，两者之间具有明显的相关性（R.2=0.999），且扩增效率良好（Eff%： 91.577），由PMA-qPCR标准曲线扩增峰图（图5）也能更直观地看出应用此方法构建标准曲线重复性和稳定性良好。

由表1可知，当理论活菌比例为0%，理论活菌数为0 cfu/mL时，PMA-qPCR的测定结果为10.6 cfu/mL与理论值存在极显著差异，且理论值不在对应的95%置信区间内。而当理论活菌比例分别为10%、20%、50%、80%、90%、100%时，PMA-qPCR的测定结果与理论活菌数均在同一数量级，且理论活菌数均在相对应的95%置信区间内。由图6可以看出，当活菌比例大于10%时，理论值与实测值之间呈良好的线性关系，这说明，当活菌比例在10%～100%时，应用该方法完全可以估计青枯菌的活菌数量，但当活菌比例小于10%，且死菌的浓度大于10.3 cfu/mL时，应用该PMA-qPCR检测活菌数量可能会出现假阳性结果。

2.3 PMA-qPCR检测青枯菌活菌的灵敏度

由表2可知，当理论活菌数为5.0×10.2～5.0×10.8cfu/mL之间时，PMA-qPCR测定结果显示：活菌数虽与理论活菌数不完全一致，但均维持在相对应的数量级上，且理论活菌数均在相对应的95%置信区间内。而当理论活菌数小于等于5.0×10.1cfu/mL时，PMA-qPCR测定结果显示的活菌数远高于理论值，且理论活菌数不在相对应的95%置信区间内（表2）。由图7可知，活菌浓度在5.0×10.2～5.0×10.8cfu/mL时，理论值与实测值之间有良好的线性关系，说明当活菌浓度在5.0×10.2～5.0×10.8cfu/mL范围内时，应用PMA-qPCR方法检测可以较客观地反映实际活菌数量，根据回归方程y=0.991 3x+0.015 1，也可计算出更接近理论值的活菌数量，而当活菌浓度小于5.0×10.2 cfu/mL时，应用该反应体系检测青枯菌活菌数量则受到局限。

3 讨论

近年来，随着我国马铃薯、生姜和番茄等作物种植面积的不断扩大，集约化生产水平的逐步提高，青枯病已成为我国常见、易发和传播迅速的重要土传病害之一[15-16]。目前国内南起20°N的海南省、北至42°N的河北坝上地区均有该病发生危害的报道[17]。然而青枯病的防治，迄今仍是生产实际中有待突破的难题之一。青枯菌在脱离寄主植物的土栖生活过程中，可能通过进入VBNC状态以应对干旱、寡营养和重金属等逆境胁迫，并在其成功完成侵染循环过程中发挥着重要作用。常规分离培养和分子检测方法，或因青枯菌的VBNC状态而造成假阴性检测结果，或因死亡菌体细胞释放出的游离DNA造成假阳性结果。因此，建立精准、可靠的青枯菌活细胞定量检测方法，对于深入探究青枯病的生态流行学规律，阻断疫情随带菌植物繁殖材料扩散传播，筛选评价不同防控策略的效果具有重要意义。

作為光敏DNA染料，PMA和EMA均无法进入具完整细胞膜结构的菌体内，但可与游离DNA通过共价氮碳键稳定结合，进而抑制随后的基于DNA扩增技术的分子检测阳性信号的产生。利用这一原理，Nogva等[18]2003年首次报道了基于EMA-qPCR技术的大肠杆菌Escherichia coli、沙门氏菌Salmonella spp.和单增李斯特菌Listeria monocytogenes的活菌定量检测技术。此后该方法被广泛应用于医药卫生、食品工业和环境科学等诸多研究领域的病原微生物和环境活菌的检测，2008年Luo等[19]首次将EMA-qPCR技术应用于植物病原细菌学研究领域，建立番茄细菌性溃疡病菌Clavibacter michiganensissubsp. michiganensis的活菌定量检测方法。2013年熊书等[12]建立了针对青枯菌的EMA-qPCR活体检测方法，可以定量区分出青枯菌死亡菌体细胞和处于VBNC状态的细胞。近年来，越来越多的相关研究表明EMA可进入某些种类细菌的活细胞内，并与DNA分子结合，使其不仅抑制死细胞PCR扩增，也抑制活细胞PCR扩增。反之，PMA较EMA多一个正电荷，更难于进入细菌活体细胞内，使得PMA在选择性抑制死细胞PCR扩增方面更具优势[20-21]。

近年来，基于PMA的PCR或qPCR技术已成为检测细菌活菌的研究热点。在青枯菌研究领域，曹梦琪等[11]建立了青枯菌5号生理小种的PMA-qPCR定量检测方法，2016年于小龙等[10]将PMA与PCR技术相结合，建立了一种快速有效区分青枯菌死/活细胞的分子检测方法。但这两种基于PMA的检测方法均存在一定的局限性，前者仅针对青枯菌5号小种的活菌检测，对其他小种菌株无效；后者无法实现样品活菌细胞的定量检测。

作为复合种，青枯菌群体异常复杂多样，为确保检测方法的特异性与通用性，本研究基于欧洲和地中海植物保护组织和美国农业部青枯菌检测规程中推荐使用的TaqMan检测方法[14]，结合PMA预处理建立了一种适用性更广、灵敏度更高的青枯菌活菌定量检测体系。Weller等[14]的研究结果中显示RS-I-F/RS-II-R适合青枯菌所有生理小种和生化变种的qPCR检测，我们在前期试验中选取了具有代表性且在Weller等研究中未提到的1号小种GMI1000、2号小种Po82、3号小种Po41、4号小种Aq以及5号小种M7等菌株进行了引物通用性验证，结果表明RS-I-F/RS-II-R适用于5个小种的PCR扩增，为了节约试验的周期和成本，我们选取侵染生姜的4号小种Aq菌株作为本次试验的研究对象。相比于SYTO9 和PI染色后通过显微观察的检测方法只适用于纯培养青枯菌的活/死菌计数，该方法具有明显的特异性，可以排除非靶标菌的干扰，因此适用性和实用性更强。本研究结果显示，PMA终浓度为15 ng/μL，是抑制10.9 cfu/mL 浓度青枯菌死菌的最优浓度，黑暗处理10 min为PMA的最优孵育时间，卤素灯下曝光5 min为去除残留PMA分子的最优曝光时间。以上结果与曹梦琪等建立的青枯菌5号小种PMA预处理体系基本一致[11]；与熊书等建立的青枯菌EMA预处理体系相比，黑暗孵育时间有所延长，曝光时间有所缩短[12]，这可能与使用的染料以及菌液浓度有关。在死、活菌混合体系中， 本研究建立的PMA-qPCR检测方法的青枯菌活菌检测下限为5.0×10.2 cfu/mL，灵敏度略高于熊书等报道的5.0×10.0个/反应（2.5×10.3 cfu/mL）以及曹梦琪等报道的10.3 cfu/mL[11-12]。本研究使用PMA-qPCR检测不同比例的活菌时，当活菌浓度为0 cfu/mL，死菌浓度为1.0×10.9 cfu/mL时，PMA-qPCR的定量检测结果为2.64×10.6 cfu/mL，与理论值差异显著。Li等在运用PMA-qPCR 法检测沙门氏菌属时发现PMA 对死细胞DNA扩增的抑制效果与靶基因扩增长度之间存在良好的相关性，扩增片段长度越长，对死菌DNA抑制效果越好，扩增的基因片段较短时无法完全抑制高浓度死菌DNA的扩增[22]，这可能是造成上述现象的原因之一。但该现象并不影响PMA-qPCR在一定范围的实际应用，当活菌的百分比大于1%或死菌比例小于99%时，使用该方法完全可以准确地测定青枯菌活菌的数量。

综上所述，目前青枯菌活菌的检测主要包括SYTO9和PI结合荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜或流式细胞仪、PMA/EMA结合PCR或qPCR的检测方法，这些方法各有利弊，当前单一方法由于在某种程度上缺乏一定的科学性，因此为了更准确地在样品中检验出活的以及VBNC状态细菌，就需要结合多种方法从多种判断角度更加完整准确地进行验证。

4 结论

本研究建立的PMA-qPCR检测方法能从混合状态下的纯培养菌中特异性定量检测出青枯菌的活菌数量， 为青枯菌活菌以及VBNC状态菌的检测提供了科学的参考依据，为植物繁殖材料的带菌检测与青枯病防控效果评价提供可靠的技术支撑。

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