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NRG1转染对骨髓基质干细胞 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达VEGF的影响

王凯　闫磊　刘志新

[Summary]目的 探讨神经调节因子1（neuregulin-1，NRG1）转染是否可以促进骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）表达血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）。方法 提取与培养3只SD大鼠的BMSCs，采用NRG1质粒转染BMSCs并提取上清液，采用ELISA法测定转染组上清液中VEGF的含量，将非转染BMSCs的样本作为对照组，采用免疫组化方法 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 细胞VEGF的表达。结果 BMSCs多数细胞处于伸展状态，呈梭形；经ELISA方法检测，转染组上清液VEGF的含量随时间增加呈增长趋势，与对照组比较，差异有统计学意义（P

[Key]骨髓基质干细胞；细胞培养；血管内皮生长因子；神经调节因子1

[] R329 [] A [] 1674-4721（2017）11（b）-0004-04

[Abstract]Objective To explore whether bone marrow stromal stem cells （BMSCs） could been promoted by NRG1 transfection to VEGF expression.Methods The BMSCs of three SD rats were isolated and cultured，BMSCs were transfected with NRG1 plasmids，and the supernates were extracted.The contents of VEGF in the supernates were detected by the method of ELISA，and the samples of BMSCs were regarded as the control group.The expression of VEGF in BMSCs was detected by immunohistochemical method.Results Most of BMSCs were stretched and spindle-shaped.The levels of VEGF in the transfection group were increased with time by ELISA detection，compared with the control group，there was significant difference （P

[Key words]Bone marrow stromal cells；Cell culture；Vascular endothelial growth factor；Neuregulin-1

骨髓基質干细胞（bone marrow stromal stem cells，BMSCs）因其低免疫源性、稳定的扩增能力和无伦理问题等优势被应用于治疗缺血性疾病的研究[1]，然而移植后BMSCs存活率过低的问题一直未被解决[2]。神经调节因子1可通过激活血管内皮ErbB2、ErbB3和ErbB4受体促进血管新生，从而改善细胞存活的微环境[3]。血管内皮生长因子是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，可促进内皮细胞生长及血管新生[4]。有报道显示，NRG1与VEGF的表达相关联。而NRG1对BMSCs表达VEGF的影响，未被查见相关报道[5]。本研究将NRG1基因转染到BMSCs，检测其VEGF的表达，旨在为提高移植后BMSCs存活率的相关研究奠定理论基础，现报道如下。

1材料与方法

1.1材料

出生2 d的SD大鼠3只（哈尔滨医科大学实验动物中心），胎牛血清、DMEM培养基（Hyclone公司），胰蛋白酶、EDTA（Gibco公司），Lipo2000（INVITROGEN公司），VEGF的ELISA试剂盒（GIBCO公司），VEGF抗体（Sigma公司），培养皿（Costar公司）。

1.2方法

1.2.1 BMSCs的提取与培养 新生2 d的SD大鼠用乙醚麻醉后处死，置于75%乙醇中浸泡杀菌5 min；在超净工作台中取出股骨，剪掉两端，暴露骨髓腔；PBS冲洗骨髓腔，800 r/min离心冲洗3 min后去上清；用含10%胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞；将悬液吸至培养皿，于37℃恒温、5%CO2培养箱中培养，每3天换液1次。当细胞铺满培养板底部80%以上时传代。

1.2.2 NRG1质粒的转染 取第3代融合至70%～80%细胞，向EP管内加入1 ml的DMEM培养液，再加入40 μl Lipo2000，混合液室温下静置5 min；向另一只EP管内加入1 ml的DMEM培养液，再加40 μl NRG1质粒，混合液室温下静置5 min；将两个EP管中溶液混匀后室温下静置20 min，将细胞培养皿中的原培养液吸出，加入6 ml的DMEM培养液，再加入DMEM/Lipo 2000/NRG1质粒；继续培养6 h后，吸出上清液，加常规培养液继续培养3 d。endprint

1.2.3 ELISA法檢测VEGF表达 NRG1转染的BMSCs培养3 d后，接种于6孔板，作为转染组，每孔含培养液3 ml（每孔底部铺有的盖玻片用于免疫组化检测）。分别从继续培养2、3、4、5 d的培养板各孔中分别吸取1 ml培养液至各EP管中（各孔吸取1 ml后，补充新鲜培养液1 ml），1000 r/min离心15～20 min，取出上清装入新EP管中，标记编号后将样本放入-80℃超低温冰箱保存备用；将未转染NRG1的BMSCs的培养液作为空白对照组。按照ELISA试剂盒说明检测每个标本中VEGF的含量。

1.2.4免疫荧光方法检测VEGF 取出6孔板中的盖玻片，D-Hank液漂洗3次；4%甲醛/PBS液固定15 min后，D-Hank液漂洗3次；1%牛血清白蛋白封闭30 min，加入100倍稀释的一抗VEGF抗体孵育100 min，D-Hank液漂洗3次；1%牛血清白蛋白封闭30 min；加二抗孵育40 min，D-Hank液漂洗3次；DAB显色1 min，D-Hank液漂洗3次；苏木精复染胞核，树胶封片。在荧光显微镜下随机选取8个视野（n=6），取图，计数。阳性细胞（棕色细胞）纯度=阳性细胞/细胞总数（蓝核细胞）×100%。

1.3统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件分析数据，计量资料以均数± 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 差（x±s）表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 BMSCs原代培养的光镜形态分析

BMSCs原代培养第3天，在倒置显微镜下，多数细胞处于伸展状态，呈梭形，折光率较低，贴于培养皿底壁；少数细胞处于未伸展状态，呈圆形，折光率较高，附于培养皿底壁或处于悬浮状态，散在分布（图1）。

2.2 NRG1转染BMSCs结果分析

NRG1转染BMSCs 3 d，荧光倒置显微镜下，如图2所示，主要由细胞的胞体均发出绿色荧光（质粒含绿色荧光蛋白eGFP基因）。由于细胞周期等因素影响，不同细胞发出的荧光强度呈现不统一状态。

2.3 ELISA法检测VEGF表达情况分析

NRG1转染BMSCs上清液中VEGF的检测结果如表1所示，NRG1转染组VEGF表达随时间增加呈增长趋势，培养2、3、4、5 d组样本与相应培养天数的对照组样本对比较，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.4 VEGF的免疫组化检测结果分析

免疫组化检测结果显示，呈棕色的细胞为VEGF表达阳性的细胞，细胞核经苏木精非特异性染色呈蓝色，可以计数细胞总数；转染组DAB显色深于对照组的颜色。转染组阳性率为91.07%，对照组阳性率为70.82%，两者比较差异有统计学意义（P<0.05）（图3）。

3讨论

为解决移植后BMSCs存活率过低的问题，科研工作者从不同角度进行了大量相关研究。有学者发现，低糖培养基、相对低的传代接种密度和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）的使用更有利于BMSCs的增殖[6]。洛伐他汀[7]和糖皮质激素氢化可的松[8]被证实能够有效地抑制缺氧无血清情况下引起的BMSCs凋亡。利用转基因技术，带有抗凋亡基因Bcl-2的BMSCs具有较高的移植存活能力并能促进病变边缘区的毛细血管新生[9]。其他公认的抗凋亡基因如Akt转染BMSCs也可减少移植后BMSCs的凋亡数量[10]，具有保护细胞生存功能的热休克蛋白家族也被应用于促进BMSCs存活的研究中，并被证实可促进移植BMSCs的存活、增殖和分化能力[11]。携带VEGF基因的BMSCs可以促进缺血脑组织新生血管的形成[12]。本实验结果显示，多数BMSCs可表达VEGF，而少数BMSCs则不表达VEGF。这可能与BMSCs存在多种亚群有关。

NRG1又称乙酰胆碱受体诱导激动剂、神经分化因子、神经胶质生长因子、感觉和运动神经元衍生因子，含表皮生长因子样活性域，属于生长和分化因子家族，主要表达在神经组织、呼吸系统和心脏，通过激活其受体ErbB发挥作用[13-14]。

有关NRG1与血管生成的关系，相关报道较少。NRG1敲除的小鼠缺血部位，毛细血管和动脉的发生减少，血流的恢复减慢；而外源性NRG1可加速血流的恢复[15]。在心脏中，NRG1主要由微血管内皮细胞和心内膜表达，能促进血管生成、减少细胞凋亡和减少氧化应激等作用[16]。心肌梗死中高表达NRG1能增加缺血心肌的微血管数量[17]。在体外，NRG1可以促进胚胎源性内皮祖细胞增殖，并经PI3K/Akt途径，增强抗凋亡的能力，促进细胞存活[18]。还有研究显示，NRG1处理的小鼠心脏中，血管新生的血管生成素1（angiopoietin-1，Ang-1）的表达明显增加[19]。本实验结果显示，NRG1还可以通过调节使VEGF过表达，促进BMSCs的存活。

NRG1与多种细胞的VEGF表达相关联。有研究显示，NRG1可显著提高糖尿病大鼠心肌组织VEGF的表达；在糖尿病和不稳定型心绞痛患者中，血清中NRG1浓度与VEGF浓度呈正相关[20]。人冠状动脉平滑肌细胞能表达ErbB2、ErbB3和ErbB4，但不能表达NRG1；NRG1处理能增强VEGF的表达[21]。在心脏发育和成熟心脏研究中发现，NRG1可通过激活受体酪氨酸激酶的磷酸化进行系列的信号转导发挥其生物学效应，使得VEGF表达增强[5，22]。还有研究显示，在结肠癌的活检标本中，NRGmRNA的表达与VEGF表达成正相关[23]。这些数据显示，NRG1可能通过调节VEGF分泌，经自分泌、旁分泌和促血管新生等多种机制促进细胞的存活。

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