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青霉素邻苯二甲醛衍生荧光法测定方法分析

王福纯

【Summary】用邻苯二甲醛衍生荧光法测定牛奶中苄青霉素残留，以此实验为例，借而对青霉素邻苯二甲醛衍生荧光法进行分析探讨。取某品牌的牛奶，准确量取1毫升，然后加5毫升的酸化乙腈震荡处理后得到样品溶液，在与 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 溶液进行荧光检测，分析结果得出，样品溶液中的衍生产物的荧光强度趋于稳定，且样品溶液的平均回收率为89.1%，与标准记录一致。所以，邻苯二甲醛衍生荧光法能够满足青霉素的检测，并且值得在以后的实验研究中推广使用。

【Key】邻苯二甲醛衍生荧光法；衍生反应；pH；共存物质

0626.13 A 1672-5158（2013）01—0351—02

由于高浓度苄青霉素残留的牛奶会影响人的身体健康，特别是长期饮用对人们的健康问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 影响十分严重，所以，找出一种能够灵敏的检测高浓度苄青霉素残留的方法具有很大的必要性。酸性条件下，青霉素的水解产物之一为青霉胺，它能与邻苯二甲醛发生衍生反应，然后生成1-硫代2-烷基异吲哚衍生物，此两类物质都具有较强的荧光，所以就建立了荧光分光光度法对苄青霉素进行测定。

1 资料与方法

1.1 仪器与试剂

本次研究所用的分析仪器为FP-750型荧光分光光度计，还用到了pHS 4型酸度计以及TG-16型离心机。所用的试剂主要有：邻苯二甲醛试剂、β-巯基乙醇、苄青霉素等试剂，还有甲酸、柠檬酸、乙酸钠、甲醇、硼酸，H3PO4、乙腈、Na2SO3以及H2O均为分析纯试剂，所用到的水为去离子水。

1.2 方法

1.2.1 衍生反应

取适量的苄青霉素标准工作液放置在小烧杯中。而后加入pH为2的稀HCl 1 mL，给予1小时的沸水浴。而后加入常规过甲酸溶液100 ul，在室温下进行30分钟的反应，而后对溶剂进行加热蒸干处理，将残渣采用pH10.0的硼酸缓冲液进行溶解，而后加入40ul的OPA衍生试剂，将其定容到4mL，并且放置15min后再进行测定，同时配制空白试剂。

1.2.2 样品溶液的配制

准确量取某品牌牛奶lmL，并加入pH值为2.0的酸化乙腈5mL，充分振荡后，让蛋白质能够沉淀完全，离心将蛋白质去除，取上清液给予少量多次加入正已烷20 mL，振荡后静置，将上层正已烷相予以弃去，从而使脂溶性物质得以除去。对下层清液进行减压挥干处理，对残渣用水进行溶解处理，之后采用上述衍生反应进行衍生处理，从而制得样品溶液。

1.3 数据处理

在本次研究过程中所得到的所有相关数据，均采用SPSS14.0统计学数据处理软件进行处理分析，当P<0.05时，我们认为数据之间有明显的统计学差异。

2 结果

通过统计分析结果得出样品溶液水解1小时，衍生反应体系pH为10.0衍生试剂的用量为40ul、衍生反应时间为15分钟的条件下进行测定，线性动态范围为2.0-500ug/L，检出限约为1.3uL左右，样品的平均加标回收率约为89.1%左右，这一结果与相关文献报道结果基本一致。

3 讨论

以苄青霉素、阿莫西林、氨苄青霉素为代表的β内酰胺类抗生素是历史最悠久的抗微生物药物，并且这几类抗生素中最重要的一类。尤其是苄青霉素，由于它的廉价且具有广谱抗菌性得以被大量使用，但当它的使用频率超过标准剂量时，就不能避免的导致牛奶中高浓度药物残留。长期饮用高浓度药物残留的牛奶会使人体肠道内的正常菌群受到抑制，导致病菌、条件致病菌大量繁殖，引起局部甚至全身性的感染。长期饮用种牛奶会使人体肠道内的正常菌群受到抑制，使致病菌、条件致病菌大量繁殖，引起全身或局部的感染。所以，许多国家对牛奶中的β内酰胺类药物尤其是苄青霉素残留进行了严格的控制。我国对牛奶中苄青霉素允许的最高限量为4μg/L。现在常用的检测方法有薄层色谱法、电位滴定法、高效液相色谱法及色/质联用测定法等，荧光分光光度法虽然效果显著，但至今还未见此类方法测定苄青霉素残留的报道。

苄青霉素是一种无荧光的物质，但是在酸性条件下，苄青霉素经加热可水解为一种叫做青霉胺的物质，并且在巯基乙醇催化条件下，邻苯二甲醛与青霉胺反应，产生1-硫代2-烷基异吲哚衍生物，产物具有较强的荧光效果。一般情况下，甲酸法使青霉胺的巯基磺酸化可有效抑制其巯基对巯基乙醇反应位点的竞争，更有利于衍生反应的发生。

3.1 苄青霉素水解时间的选择

苄青霉素水解，在酸性条件下，苄青霉素的β内酰胺发生电子转移，导致分子重排，pH为2时，形成青霉二酸，进一步加热水解，得到目标产物青霉胺。显然，水解时间会对青霉胺的形成造成影响，在固定pH的情况下，使固定浓度的苄青霉素溶液处于沸水浴中分别水解20、30、40、50和60min，然后加入定量的甲酸，磺酸化反应30 min，蒸干溶剂，用pH 10.0的硼酸缓冲液溶解残渣，再加入50μL OPA衍生试剂，定容至4 mL，反应30 min。然后测定不同水解时间下产物的荧光强度。实验所得：水解50分钟都得到的衍生产物荧光强度相比之下稳定，所以，为保证水解彻底，一般水解时间定为60 min。

3.2 常规过甲酸氧化处理对衍生反应的影响

青霉胺是一种含硫氨基酸，在与OPA衍生试剂反应生成异吲哚衍生物时，其巯基将会和β巯基乙醇发生竞争性反应，使目标衍生产物的生成量受到影响。如果先用常规过甲酸将二硫键打开，并进一步将青霉胺中的巯基氧化成磺酸基，然后再与OPA衍生试剂反应，则可有效解决此问题。将上述水解1 h的苄青霉素溶液分别加入100μL常规过甲酸溶液和100μL水，其余处理方法同上。从图1结果可看出，加入常规过甲酸氧化处理的溶液与未经此处理的溶液相比，荧光强度增大了5倍。

3.3 pH对衍生反应的影响

为了解pH对衍生反应的影响，取经上述水解和过甲酸氧化处理并蒸干后的苄青霉素溶液残渣系列，分别用乙酸盐缓冲液（pH 4.0、pH 5.0）、柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）、磷酸盐缓冲液（pH 7.0、pH 8.0）、硼酸盐缓冲液（pH 9.0、pH 10.0）和碳酸盐缓冲液（pH 11.0、12.0）溶解，衍生反应条件同上。当pH10.0后，背景干扰也随之增大，因此衍生反应的pH条件选择为10.0。

3.4 OPA衍生试剂用量与衍生反应时间的选择

在上述优化的反应条件下，分别考察了不同OPA衍生试剂加入量对产率的影响。结果表明，OPA衍生试剂与苄青霉素的摩尔浓度比大于2：1时衍生产物的产率恒定，这摩尔比对应于OPA衍生试剂的加入量为4μL。然而，当OPA衍生试剂在这个加入量时，衍生反应速度很慢，导致产物的荧光强度随时间递增，约50 min才能达到稳定值。随着OPA衍生试剂加入量的逐步增加，反应速度逐渐加快，荧光强度趋稳需时将越来越短，但对应的背景干扰会越来越大。综合考虑两者的影响，选择OPA衍生试剂加入量为40μL。当反应时间大于15 min时，荧光强度值几乎不变，所以衍生反应时间确定为15 min。此外，经检验，在室温条件下，衍生产物可在3 h内保持稳定，能够满足多样品测定的需要。

结束语

实验证明，邻苯二甲醛衍生荧光法适用于青霉素的测定，而且相对而言此方法操作简单，结果准确，对于检测的各项要求也都能予以满足，所以，在以后的实验研究中，建议推广使用。

Reference

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