PAK1和PAK4在不同毛色绵羊皮肤中的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达与定位

赵红霞，王志鹏，王天元，赛务加甫，庞全海*

（1.山西农业大学动物医学学院，山西太谷 030801；2.山西中国辐射研究院，山西太原 030000；3.山西省柳林县动物疫病预防控制中心，山西柳林 033300；4.石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003）

对哺乳动物的毛色长期研究发现，哺乳动物的毛色、眼睛颜色和肤色由体内黑色素的数量、质量和分布状况决定[1]。PAK 家族包括PAK1和PAK4[2]。有实验证实PAK4 是CREB 的一个关键调节因子[3]，它作用于小眼畸形相关转录因子（MITF）的上游，MITF 是黑素生成的主要转录因子[4]，激活的PAK4 通过2 条不同的信号通路促进黑素合成：CREB/MITF/酪氨酸酶和β-catenin/MITF 信号通路[5]。同时有研究表明PAK1和PAK4参与皮肤细胞黑素合成[6]。PAK1 调控的信号转导通路包括MAPK、AKT、WNT1/β-catenin、ERα、BAD 和NF-κB 等增殖和生存通路[7]。PAK1 还参与了细胞运动的调节，传递控制细胞骨架动态、细胞形状和粘附的各种信号通路[8]。PAK4 是一个信号整合子，调节许多基本的细胞过程[9]，包括肌动蛋白细胞骨架动力学、细胞形态和运动、细胞存活、胚胎发育、免疫防御和致癌转化[10]。国内外已有对小鼠中PAK1和PAK4基因影响黑色素生成等方面调控的研究，但在绵羊中PAK1 和PAK4 的相关研究尚未发现。本实验以白色、棕色和黑色绵羊为研究对象，通过qRT-PCR、Western Blotting、免疫组织化学等技术 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 不同毛色绵羊皮肤中PAK1 和PAK4 的表达与定位，为其他品种绵羊毛色的研究奠定基础，增进对绵羊毛色生成调控机制的理解。

1 材料与方法

1.1 实验取材 在山西农业大学羊场随机选取健康性成熟的白色、棕色和黑色哈萨克绵羊各3 只，取背部皮肤组织各3 块。其中2 块放入液氮中用于提取总RNA 和蛋白，1 块直接放入4%的甲醛固定液中固定，制作组织切片，用于免疫组织化学分析。

1.2 实验试剂 Trizol Reagent（Invitrogen 公司）；Prime ScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）反转录试剂盒、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）试剂盒（TaKaRa 公司），PAK1 兔抗多克隆抗体（武汉三鹰生物技术公司）；PAK4 兔抗多克隆抗体（武汉三鹰生物技术公司）；Rabbit anti-β-actin 多克隆抗体、Goat Anti-Rabbit IgG（武汉三鹰生物技术公司）；组织蛋白提取试剂盒、凝胶制备试剂盒、DAB 试剂盒、BCA 蛋白浓度试剂盒、ECL Plus 超敏发光液（北京索莱宝生物技术公司）；免疫组化试剂盒（北京中杉金桥）。

1.3 实验方法

1.3.1 总RNA 提取及cDNA 的合成 使用Trizol 试剂分离保存于液氮中的黑、棕、白色绵羊皮肤组织的总RNA，用PrimeScriptTM RT Master Mix（Perfect Real Time）反转录试剂盒反转录合成cDNA，-20℃冰箱保存。

1.3.2 引物的设计与合成 在NCBI 上检索绵羊的PAK1和PAK4序列并使用Premier 5.0 引物设计软件设计荧光定量PCR 扩增引物，引物由宝生物工程（大连）有限公司设计并合成，引物序列见表1。

表1 引物序列及PCR 扩增条件

1.3.3 qRT-PCR 检测 根据TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）扩增特异性DNA 序列，反应体系25 μL：TB GreenTMPremix Ex TaqTMII 12.5 μL，10 μmol/μL的 正、反向引物各0.8 μL，50 ng/μL 的cDNA模板2.0 μL，ROX Reference Dye II 0.4 μL 和ddH2O（灭菌蒸馏水）6.0 μL。反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，63℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40 个循环。结束后得到扩增曲线、熔解曲线和CT 值，用2-ΔΔCT法计算定量结果。

1.3.4 Western Boltting 检测 将存于液氮中的样品组织研磨后，根据组织蛋白提取试剂盒提取总蛋白，使用核酸蛋白测定仪测定其浓度。在10%SDS-PAGE 电泳分离后，200 mA 转膜90 min，5%的脱脂奶粉封闭1 h，4℃过夜孵育一抗（1:1 000 稀释PAK1 兔抗多克隆抗体；1:500 稀释PAK4 兔抗多克隆抗体）。次日TBST 缓冲液洗膜，10 min×3，孵育二抗（1:5 000，HRP-山羊抗兔IgG），室温摇床1 h，TBST 缓冲液10 min×3，最后用胶片暗室曝光。使用Image-Pro Plus8.0 软件检测目的蛋白和内参灰度值，用SPSS 软件进行统计分析。

1.3.5 免疫组织化学检测 将置于4% 甲醛固定液固定24 h 的样品组织取出，经梯度酒精脱水后进行包埋并制作切片。将切片置于柠檬酸钠修复液中进行抗原修复，然后滴加内源性过氧化物酶阻断剂，室温下孵育10 min，PBS 冲洗。滴加山羊血清工作液室温孵育15 min，弃去血清，切片一侧滴加1:100 稀释的Rabbit Anti-PAK1 抗体（1:50 稀释的Rabbit Anti-PAK4 抗体），阴性对照组滴加PBS，4℃过夜孵育。次日PBS 冲洗之后滴加生物素标记山羊抗兔IgG 聚合物，室温孵育15 min，PBS 冲洗，滴加辣根酶标记链霉卵白素，室温孵育15 min，PBS 冲洗；滴加DAB 显色液，使用显微镜镜下控制显色时间，将染色控制在最佳状态，PBS 冲洗；苏木素复染40 s，蒸馏水冲洗，75%的盐酸酒精分化1 min。最后脱水，透明，中性树胶封片。使用光学显微镜对实验结果进行拍照。

1.4 数据分析 采用GraphPad Prism 8 软件对数据作单因素方差分析，实验结果表示为平均值± 标准偏差（SD）。P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著。

2 结果

2.1PAK1、PAK4在不同毛色绵羊皮肤组织中mRNA的相对表达量 qRT-PCR 结果显示（图1A），PAK1mRNA 在黑色绵羊皮肤中的表达量分别是棕色和白色的3.05 倍和7.29 倍（P＜0.01），棕色绵羊皮肤中的表达量是白色的2.39 倍（P＜0.01）。图1BPAK4mRNA在黑色绵羊皮肤中的表达量分别是棕色和白色的3.47倍和7.7 倍（P＜0.01），棕色绵羊皮肤中的表达量是白色的2.22 倍（P＜0.05）。

图1 PAK1 和PAK4 mRNA 的相对表达量

2.2 PAK1、PAK4 蛋白在不同毛色绵羊皮肤组织中的相对表达量 Western Blotting 结果显示（图2A），在黑、棕和白色绵羊皮肤组织中均存在与PAK1、PAK4 多克隆抗体发生阳性反应的条带，PAK1、PAK4 和GAPDH分别在分子量为64 kDa、65 kDa 和36 kDa 检测到条带。使用Image-Pro Plus 6.0 软件对目的蛋白曝光出印迹的面积和灰度值计算出相关数据，将其同GAPDH 的条带值相比较，经过统计分析的结果可知，PAK1 蛋白在黑色绵羊皮肤中的表达量是棕色绵羊皮肤的1.26倍，是白色绵羊皮肤的1.34 倍；PAK4 蛋白在棕色和黑色绵羊皮肤中的表达量分别是白色绵羊皮肤的1.81倍和2.2 倍，黑色绵羊皮肤的表达量是棕色绵羊皮肤的1.21 倍。

图2 PAK1 和PAK4 蛋白在黑色、棕色和白色绵羊皮肤的蛋白相对表达量

2.3 不同毛色绵羊皮肤组织中PAK1 蛋白和PAK4 蛋白的表达与定位 通过免疫组织化学对PAK1 蛋白和PAK4 蛋白在绵羊皮肤组织中的表达进行定位研究，结果显示（图3），PAK1 蛋白在白色绵羊的表皮、根鞘、毛干中有阳性表达，在黑色绵羊的表皮、根鞘、毛球中有阳性表达，在棕色绵羊的表皮、根鞘中有阳性表达，而相应的阴性对照中无表达。PAK4 蛋白在白色、黑色和棕色绵羊的表皮、根鞘、毛基质中均有表达，而相应的阴性对照中无表达（图4）。

图3 PAK1 蛋白在绵羊皮肤中的定位

图4 PAK4 蛋白在绵羊皮肤中的定位

3 讨 论

毛囊是哺乳动物特有的皮肤附属器官[11]，具有复杂的形态变化和生理发育过程[12]。毛囊数量庞大且位于体表，易于操作，是研究细胞增殖、分化、凋亡等科学问题的良好模型[13]。研究发现，含羞草四肽（MFFY、MFWY 和MFYY）和组氨酸衍生物（H1-3）有抗黑素活性。这些化合物的抗黑色素生成活性很可能主要是由于它们的抗PAK1 作用[6]。许多草本PAK1 阻断剂，如蜂胶和姜黄素，已被证明通过下调酪氨酸酶以及黑素合成/致癌转录因子（如β-catenin 和MITF）来抑制黑素合成[14]，β-catenin 是PAK1 和PAK4 等激酶的直接底物之一，这些转录因子对酪氨酸酶基因的激活是必不可少的[15]。

PAK1 通过在Ser 675 磷酸化直接激活β-catenin[16]，导致MITF 的激活，这对于编码黑素生成酶如酪氨酸酶（Tyr）基因的表达是必需的。PAK4 也通过激活2 种转录因子CREB 和β-catenin 参与同一黑色素瘤细胞系的黑色素生成[17]，这2 种转录因子对MIFT 激活都是必需的[18]。本实验发现PAK1 mRNA 和蛋白在黑色绵羊皮肤中的表达量最高，棕色次之，白色最低。前人研究发现从人黑素细胞中分离出的富含黑素小体的组分表达PAK1 和N-WASP。PAK1 激酶活性的降低会影响黑素生成[19]。

PAK4 是生物学界最新发现的一类蛋白因子[20]，它在细胞信号转导过程中起非常重要的作用[21]。PAK1 负责诱导性黑素生成，而PAK4 主要负责基础黑素生成[17]。PAK4 是CREB 的关键调节因子[22]，在UV/α-MSH 诱导的黑素合成中，PAK4 上调了MITF 的转录[23]。PAK4 通过CREB 和Wnt/β-catenin 信号通路促进α-MSH/UVB诱导黑素合成，并提示PAK4 可能是治疗色素沉着障碍的潜在靶点[5]。本实验发现PAK4mRNA 和蛋白在黑色绵羊皮肤中的表达量最高，棕色次之，白色最低，与前人研究结果一致[5]。推测PAK4 可能通过诱导黑色素的生成进而调控哈萨克绵羊毛色生成过程。

哺乳动物的毛色主要取决于黑色素在皮肤和头发中的类型、数量和分布[24]，在对小鼠的研究中发现黑色素是在毛囊球茎中产生的[25]。在老鼠皮肤的毛发部分，分化的黑素细胞被限制在毛囊的球状区域，在那里它们负责毛发的色素沉积。本实验也发现PAK1 蛋白在白色绵羊的表皮、根鞘、毛干中有阳性表达，在黑色绵羊的表皮、根鞘、毛球中有阳性表达，在棕色绵羊的表皮、根鞘中有阳性表达。PAK4 蛋白在白色、黑色和棕色绵羊的表皮、根鞘还有毛基质中也有表达，表明PAK1 和PAK4 对毛囊发育及毛色形成具有一定作用。

4 结 论

本实验结果表明，PAK1和PAK4基因在棕色和黑色绵羊皮肤中的相对表达量显著高于白色绵羊皮肤；PAK1 和PAK4 蛋白在棕色和黑色绵羊皮肤中的相对表达量显著高于白色绵羊皮肤；PAK1 蛋白在白色绵羊的表皮、根鞘、毛干表达，在黑色绵羊的表皮、根鞘、毛球表达，在棕色绵羊的表皮、根鞘表达，PAK4 蛋白在白色、黑色和棕色绵羊的表皮、根鞘、毛基质中均有表达。综上表明，PAK1 和PAK4 可能通过诱导黑色素的生成进而调控哈萨克绵羊毛色生成过程。

-全文完-