慢病毒包装纯化滴度测定及感染RevisedbyBLUEontheafternoonofDecember12,2020.慢病毒包装纯化滴度测定及感染慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染包装包装细胞Lenti-X?LentiviralExpressionSystemsUserManual.pdf（P11）;Lenti-X?shRNAExpressionSystemsUserManual.pdf(P16)病毒载体及包装质粒病毒载体：DNA组构建及中量提取；包装质粒：商品化产品（Lenti-X?LentiviralExpressionSystemsUse...
RevisedbyBLUEontheafternoonofDecember12,2020.慢病毒包装纯化滴度测定及感染慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染包装包装细胞Lenti-X?LentiviralExpressionSystemsUserManual.pdf（P11）;Lenti-X?shRNAExpressionSystemsUserManual.pdf(P16)病毒载体及包装质粒病毒载体：DNA组构建及中量提取；包装质粒：商品化产品（Lenti-X?LentiviralExpressionSystemsUserManual.pdf（P12）;Lenti-X?shRNAExpressionSystemsUserManual.pdf(P17)）或DNA中量提取（目前唯一使用来源）；细胞转染方法一：Lenti-X?LentiviralExpressionSystemsUserManual.pdf（P12）;Lenti-X?shRNAExpressionSystemsUserManual.pdf(P17)；方法二：按照进行，简要中文说明如下：a.转染前24小时，把4–5x106个293T细胞传代至10cm培养皿中，加入完全培养基至终体积10ml，培养过夜，转染时，细胞密度为80–90%；b.293T细胞转染前2小时换上9ml新鲜的完全培养基；c.用之前充分混匀PLUSReagent，在EP管中加入15ug的DNA混合物(pLVX-shRNAPlasmidDNA：pMDLg：pRes-Rev：pCMV-VSV-G的摩尔比为1：1：1：1)，15ul的PLUSReagent，用Opti-MEM定容到500ul，标记为Tube1，温和混匀，室温孵育5分钟；d.充分混匀MixLipofectamineLTX，在EP管中加入45ul的MixLipofectamineLTX和455ul的Opti-MEM，标记为Tube2，温和混匀；e.将Tube1的溶液加到Tube2中，温和混匀，室温孵育5分钟；Tube1(PlasmidDNA)Tube2(LTX)15ugDNAMIX(pLVX-shRNAPlasmidDNA：pMDLg：pRes-Rev：pCMV-VSV-G=1:1:1:1)455μlOpti-MEM15μlPLUSReagent45μlMixLipofectamineLTXUpto500μlOpti-MEM500μlTotalVolume500μlTotalVolumef.将1ml转染复合物逐滴加入前一天种好细胞的100mm皿中，边加边摇匀。g.将细胞放入置于37℃、5%CO2培养箱中培养，12小时后换上新鲜的培养基继续培养。h.转染后48-72h，收取培养上清，500g离心10min或利用0.45μm低蛋白吸附滤膜去除细胞碎片和团聚的病毒；方法三：C0508磷酸钙法细胞转染试剂盒.pdf（目前唯一使用方法）病毒上清收集转染后12h,48h,72h分别收集一次；纯化方法一：(i)病毒上清（接一、包装4.病毒收集）.(ii)Add51mlofa50%PEG6000solution.(iii)Add21.7mlofa4MNaClstocksolution.(iv)Add23.3mlofPBS.Thiswillresultinafinalvolumeof300ml.ThefinalPEG6000concentrationwillbe8.5%andthefinalNaClconcentrationwillbeB0.3M.(v)Distributethesampleas150-mlaliquotsintwo250-mlpolypropylenewide-mouthedbottles.(vi)Storethebottlesat41Cfor1.5h.Mixcontentsevery20–30min.(vii)Centrifugebottlesat7,000gfor10minat41CusingaBeckmanfixed-angelJLA-10.500rotor.(viii)Aftercentrifugation,awhitepelletshouldbevisible.(ix)Carefullydecantthesupernatantandadd1.2mlof50mMTris-HCl,pH7.4,perbottle.Resuspendthepelletsbyvigorouslypipettingliquidupanddown.(x)Vortexthebottlesvigorouslyfor20–30stofurtherresuspendthepellets.(xi)Transferthevectorsuspensionintoscrew-capmicrofugetubesinaliquotsof100ml.(xii)Snap-freezethetubesincrusheddryiceandstoreat-80。C.a.把去除细胞碎片和团聚的病毒上清转移至离心管，按照10ml的病毒上清加入2.5ml的50%PEG6000混合；b.加入1.064ml的4M的NaCl混匀；c.加入1.142ml的PBS混匀；d.4°C下，孵育1.5h，每20-30min颠倒混匀；e.4°C下，7000g离心10min。f.小心移除上清，切勿触动白色沉淀，如果白色沉淀出现松动，可以在7000g下短暂离心；g.加入原病毒上清1/200to1/100体积的PBS重悬沉淀病毒粒子；h.立即对浓缩纯化的病毒粒子进行滴度测定，并分装后（50-100ul/管）冻存于-80°C超低温冰箱中；上述所需试剂配制方法见Production,concentrationandtitrationofpseudotypedHIV-1-basedlentiviralvectors.pdf（P3）方法二：Lenti-X?Concentrator.pdf滴度测定病毒滴度测定-针对有绿色荧光蛋白标记的病毒.doc；病毒滴度测定-针对没有绿色荧光蛋白标记的病毒.doc；感染Lenti-X?LentiviralExpressionSystemsUserManual.pdf（P16）;Lenti-X?shRNAExpressionSystemsUserManual.pdf(P20)；Lenti-X?Concentrator.pdf（病毒感染增强剂使用说明）；a.感染前24小时，把细胞传代至35mm平皿中，加入完全培养基至终体积3ml，培养过夜，感染时，细胞密度为80–90%；b.把冻存于-80°C的病毒取出并在室温下冻融；c.用新的完全培养基更换培养液，并加入冻融的病毒粒子（MOI为5-10）和polybrene（4μg/ml），培养液终体积为3ml；d.感染8-24h后，用新3-4ml新完全培养基更换感染培养液；e.感染48小时后收取细胞进行QPCR检测，感染72小时后收取细胞进行WB检测；
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