KIRREL在胃癌中的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达及其对胃癌血管生成的影响

陈 硕，张明军，王 涛

胃癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，发病率居世界第5位，死亡率居第4位[1]。其5年生存率仅有18%左右[2]。目前胃癌主要的治疗手段包括手术、化疗、放疗、免疫治疗与靶向治疗。其中在靶向治疗领域中，与其他恶性肿瘤相比，针对胃癌的靶向治疗药物相对较少，如雷莫芦单抗(靶点为VEGFR-2)和曲妥珠单抗(针对HER-2阳性患者)。因此，有必要进一步探索新的基因来作为胃癌治疗的新靶点。

类IRRE蛋白1系属(Kin of IRRE-like protein 1，KIRREL)是免疫球蛋白超家族的一员，在肾足细胞的过滤缝隙中表达，在结构和序列上与肾病蛋白(nephrin)相似。该蛋白的C端结构域能与足突蛋白(Podocin，NPHS2)相互作用[3]。近年来，研究发现KIRREL在多种恶性肿瘤中高表达。然而，KIRREL与胃癌相关的研究较少，其在胃癌中的作用机制尚不明确。为了明确KIRREL在胃癌中的作用，该研究拟 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 KIRREL在胃癌中的表达，并初步探讨KIRREL沉默或过表达对胃癌血管生成的影响。

1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法

1.1 组织标本选取胃癌组织及癌旁组织各10例，均来自安徽医科大学第二附属医院，其中男性7例，女性3例，年龄40～70岁。纳入标准：① 术前通过胃镜和病理检查明确诊断为胃癌的患者；② 拟行胃癌根治手术者；③ 心、肺等重要的脏器功能良好,能够承受胃癌手术打击；④ 已签署知情同意书。排除标准：① 有其他恶性肿瘤病史；② 既往有放化疗病史。本研究经安徽医科大学第二附属医院伦理评审委员会批准，伦理批号YX2022075(F1)。

1.2 实验细胞人胃癌细胞系AGS、SNU-5，人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)购于北纳创联生物科技有限公司。

1.3 实验仪器CO2培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；全自动酶标仪(北京六一生物科技有限公司)；DYY-7B型稳压稳流电泳仪(美国Bio-Rad公司)；垂直电泳槽、转移电泳槽(美国伯乐公司)；转膜仪(美国Hoefer公司)；全自动化学发光图像分析系统(上海天能科技有限公司)等。

1.4 主要试剂完全RPMI-1640培养基、完全F12培养基(江苏凯基生物技术股份有限公司)；MCE完全培养基(美国SCIENCELL公司)；RIPA细胞裂解液(北京普利莱基因技术有限公司)；HIF-1α一抗、VEGF一抗(武汉三鹰生物技术有限公司)；KIRREL一抗(美国Bioss公司)；GAPDH一抗、辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)二抗、辣根酶标记山羊抗鼠IgG(H+L)二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)；DAB显色试剂盒、中性树脂(北京康为世纪生物科技有限公司)；苏木精染色试剂盒(武汉博士德生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 有限公司)等。

1.5 构建稳转细胞系将AGS、SNU-5细胞复苏、传代培养，加入转染试剂与Opti-MEM，分别转染KIRREL过表达和干扰质粒，于37 ℃、5% CO2条件下培养8 h，更换培养基继续培养。转染后24 h判定转染效率，确定转染成功后，再次更换培养基培养24 h。KIRREL引物序列F：5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′，R：5′-AGTCCCGTCCTAAAATGTC-3′；shRNA引物序列见表1。

表1 shRNA的引物序列

1.6 Western blot用移液枪吸弃培养皿中的细胞培养液，每孔加入100 μl细胞裂解液，置于冰上20 min。12 000 r/min离心10 min取上清液，测定蛋白浓度。蛋白变性，上样，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，3%脱脂牛奶孵育1 h。分别在KIRREL(1 ∶1 000稀释)、HIF-1α(1 ∶2 000稀释)、VEGF(1 ∶1 000稀释)、GAPDH(1 ∶2 000稀释)一抗溶液中孵育，4 ℃过夜；洗膜后，将加入目的一抗的膜在1 ∶2 000稀释的根酶标记山羊抗兔二抗溶液中室温孵育2 h，加入内参一抗的膜在1 ∶2 000稀释的辣根酶标记山羊抗鼠二抗溶液中室温孵育2 h。再次洗膜，在膜上滴加ECL发光液，在凝胶成像系统中曝光。用“Quantity one”软件分析各条带灰度值。

1.7 免疫组化将胃癌组织和癌旁组织进行石蜡包埋后，组织切片进行免疫组化检测。在1 ∶200稀释的KIRREL一抗溶液中孵育，4 ℃过夜；复温后加入1 ∶100稀释的辣根酶标记山羊抗兔二抗，孵育30 min。DAB显色5 min。苏木精染5 min，接着分化、返蓝、脱水、透明、封片、镜检。目的蛋白为棕色，细胞核为蓝紫色。根据阳性细胞所占比例和染色程度进行分析。

1.8 血管形成实验收集AGS细胞、SNU-5细胞的各组上清液，重悬HUVEC进行成管实验。将在4 ℃中融化的基质胶铺在提前预冷的24孔板中，每孔250 μl，注意不要出现气泡，放置在培养箱中凝固30 min；接着将各组细胞消化计数，设置3个复孔，每孔8×104个细胞，6 h后拍照观察细胞成管情况，图像从5个连续的视野中获得，放大倍数 ×100。选取管长度和节点进行定量分析。

2 结果

2.1 KIRREL在胃癌组织中的表达分析为了检测KIRREL在胃癌中的表达水平，将临床收集的10对胃癌组织和癌旁组织分别提取目的蛋白。首先通过免疫组化法检测发现：KIRREL在胃癌组织中呈高表达，而在癌旁组织中呈低表达，见图1A、1B。其次，Western blot结果表明在大约70%(7/10)的胃癌组织中,KIRREL的蛋白表达高于癌旁组织。其中，在胃癌组织、癌旁组织中的表达量分别为1.05±0.22及0.63±0.14，差异有统计学意义(t=2.257，P<0.05)，见图1C。

图1 KIRREL在胃癌组织中的表达分析

2.2 构建KIRREL干扰和过表达胃癌细胞株根据前期预实验结果，选择高表达KIRREL的胃癌细胞株SNU-5和低表达KIRREL的胃癌细胞株AGS作为研究对象。在SNU-5细胞中诱导转染了稳定的KIRREL基因慢病毒干扰载体(LV-shKIRREL),在AGS细胞中诱导转染了稳定的KIRREL基因慢病毒过表达载体(LV-KIRREL),同时分别设置了一组转染空载质粒的细胞株(LV-shNC，LV-NC)。以GAPDH作为内参，使用Western blot检测各组细胞中KIRREL的蛋白表达量，验证转染效果。结果如图,与LV-NC组比较，LV-KIRREL组的KIRREL蛋白表达量显著上调(t=3.748，P<0.05)，见图2B。本研究选择了KIRREL慢病毒LV-shKIRREL1组进行后续实验。

2.3 KIRREL对胃癌血管生成的影响为了验证KIRREL对胃癌血管生成的影响， Western blot法检测发现，在AGS细胞中，与LV-NC组相比，LV-KIRREL组HIF-1α、VEGF的蛋白表达量增多；而在SNU-5细胞中，LV-shKIRREL组与LV-shNC组相比，HIF-1α、VEGF的蛋白表达量明显减少，见图3A。另外，体外血管形成实验结果显示，在AGS细胞中，与LV-NC组相比，LV-KIRREL组HUVEC的管长度和节点明显增加(t=7.603、5.041，P<0.05)，见图3B。

3 讨论

KIRREL主要位于足细胞膜，能根据分子量、电荷和形状限制大分子的通过，参与维持裂隙隔膜结构和功能的完整性。有研究[4]表明，KIRREL是一种信号分子，可以激活典型的蛋白激酶级联反应。虽然KIRREL在胃癌中的作用机制尚未见报道，但KIRREL已经被证实在多种恶性肿瘤中高表达，且与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。例如，Hu et al[5]综合分析了3个胰腺癌相关的微阵列数据集，发现KIRREL在胰腺癌中过表达，可作为胰腺癌的治疗新靶点。Chen et al[6]对302例乳腺癌组织和50例正常乳腺组织进行分析，结果提示KIRREL在乳腺癌中过表达，可作为乳腺癌患者预后不良的独立预测指标。还有研究[7]显示KIRREL基因甲基化可能通过促进细胞增殖和转移，从而在骨肉瘤的发病机制中起重要作用。

图2 构建KIRREL干扰和过表达胃癌细胞株

本课题组前期研究[8]显示KIRREL基因在胃癌中呈高表达，表达水平的高低与肿瘤大小、T分期、年龄等因素相关，且高表达的KIRREL mRNA与总生存时间相关。在此次研究中，Western blot、免疫组化检测结果均显示，与癌旁组织相比，KIRREL在胃癌组织中表达上调，符合前期的研究结果。此外，该研究还通过实验验证了KIRREL可能促进胃癌的血管生成。

在肿瘤进展中，血管生成持续异常，这为增殖的肿瘤细胞提供了充足的营养和氧气，从而促进肿瘤细胞的生长、浸润和转移[9-10]。研究[11]表明，胃癌是一种高度血管生成的癌症。在低氧条件下，HIF-1α被激活，并通过识别启动子区域的共同缺氧反应元件促进血管生成因子的转录，这是肿瘤血管生成的前提条件[12]。且在这一过程中，VEGF是促进肿瘤血管生成的关键细胞因子，刺激肿瘤细胞的增殖和迁移，抑制凋亡并调节其通透性[13]。因此，为了进一步探讨KIRREL与胃癌血管生成的关系，本研究通过Western blot实验发现KIRREL过表达上调了HIF-1α和VEGF的表达，而KIRREL沉默则抑制了HIF-1α和VEGF的表达，这证实了KIRREL可能对胃癌血管生成具有促进作用。此外，体外血管形成实验的结果显示KIRREL促进了HUVEC的血管形成能力，这进一步证实了KIRREL促进胃癌血管生成这一观点。

图3 KIRREL对胃癌血管生成的影响

综上所述，KIRREL在胃癌组织中过表达，并促进胃癌的血管生成。这一结论为治疗和预防胃癌提供了重要的理论依据。本研究的不足之处在于收集的临床标本数量较少，实验数据可能存在偏倚，信服力偏低，要更好地了解KIRREL在胃癌中的潜在功能，还需要进一步扩大样本量。

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