mm_fs_cnj_0351 出口商品中粪链球菌群检验方法

mm_fs_cnj_0351 出口商品中粪链球菌群检验方法 MM_FS_CNJ_0351出口商品 粪链球菌群 多管法 滤膜法 平板计数法 MM_FS_CNJ_0351 出口商品中粪链球菌群检验方法 1.适用范围 本方法适用于食品中粪链球菌群的检验，也适用于羽绒制品填充料中粪链球菌群的检验。 2.主要试剂和仪器 2.1.主要试剂(培养基) 叠氮化钠葡萄糖肉汤[参见附录A(补充件)中A1]; 参见附录A(补充件)中A2];Pfizer肠球菌选择性琼脂(PSE琼脂)[ KF链球菌琼脂[参见附录A(补充件)中A3]; 脑心浸液[参见附录A(补充件)中A4]; 脑心浸液琼脂[参见附录A(补充件)中A5]。 2.2.主要仪器 取样工具:镊子、手术剪、刮勺、乳胶手套等; 具盖样品瓶、金属样品桶或其他容器; 高压蒸汽灭菌器; 天平:称量1000g。感量0.01g; 均质器及1000mL具盖均质杯; 移液管:容量1 mL，10mL(大口径); 培养皿:60mm×15mm，90mm×15mm或50mm×12mm玻璃皿或塑料皿; 各种规格的培养基容器; 玻璃、耐高温塑料、陶瓷或不锈钢过滤器; 滤膜:直径47mm，微孔直径0.45?0.4μm，亦可用性能相同的其他滤膜替代; 振荡器; 恒温培养箱:36?1?，44.5?0.5?; 恒温水浴箱:44.5?0.5?。 3.试样的抽取与制备 3.1.检验批 以不超过2500件(以商品包装件数计，如包、箱、袋等)为一检验批。如另有规定，则按不同商品所规定的报验批为检验批。 同一批商品应具有相同的特征，如包装、标记、产地、规格和等级等。 3.2.抽样数量 —在无特殊规定时，按照公式?N,2(式中N为该批商品的总件数)，遵循四舍五入规则计算抽样件数;如另有规定，则按不同商品所规定的抽样数进行抽样。 3.3.抽样方法与样品保存 按3.2规定的抽样件数随机抽取，以无菌操作逐件开启。 3.3.1.食品:对于有内包装(如袋、瓶或罐装者)的食品，每件至少取一完整未开封的小包装单位作为原始样品;如无内包装或包装较大者，则使用灭菌工具取样。原始样品总量不少于1 kg(1L)，装入清洁灭菌容器内，加封后标明标记。如不能及时检验，冷冻食品样品应保持冷冻状态;非冷冻样品需在2,5?保存。 3.3.2.羽绒制品填充料:通常情况下是在填充前临时包内取样，必要时从制品中取样。使用灭菌镊子或戴经消毒的乳胶手套从每件的不同部位抽取100g作原始样品，放入灭菌样品桶内，加封后标明标记。如不能及时检验，样品需在2,5?保存。 3.4.样品制备 液体食品 3.4.1. 用无菌吸管吸取25mL样品，放入装有225mL灭菌生理盐水的500mL稀释瓶中，迅速振摇，充分混匀，制成1?10样品匀液。 3.4.2.水产品、禽类制品 以无菌操作取25g样品放入装有225mL灭菌生理盐水的均质杯内，以8000r,min均质1,2min，制成1?10样品匀液。 3.4.3.羽绒制品填充料 取10g样品放入适当大小的锥形烧瓶内，加入400mL无菌水于锥形烧瓶中，用灭菌胶塞塞紧瓶口，置振荡器振荡10min。 对上述各种样品稀释液可根据需要进一步按10倍递增稀释。 4.过程简述 4.1.接种培养和计数 4.1.1.多管法 4.1.1.1.用适当稀释的样液接种一套叠氮化钠葡萄糖肉汤管。接种量为1mL或1mL以下时，使用10mL单料管;接种量为10mL，使用10mL双料管。接种后的试管置35?1?培养24?2h，检查各试管的混浊情况。若混浊不明显，继续培养至48?2h后记录结果。 4.1.1.2.培养24?2或48?2h之后，对所有呈现混浊的叠氮化钠葡萄糖肉汤管进行确证试验。用接种环将各管的培养物划线于PSE琼脂平板上，倒置平皿于36?1?培养24?2h。琼脂平板上出现的带棕色环的棕黑色菌落，确证为粪链球菌群细菌。 4.1.1.3.MPN值的记录和计算 根据接种的样品量和确证为粪链球菌群细菌的管数，查MPN表[参见附录B(补充件)]，报告每克(毫升)样品中粪链球菌群MPN值。 4.1.2.滤膜法 4.1.2.1.平板培养基制备:倾注或吸取4,5mL融化的KF琼脂于平皿(60mm×15mm)中，若平板表面有气泡，可用火焰灼除。若使用盖合紧密的塑料培养皿(50mm×12mm)，可预先制成储备平板，于4,10?冰箱内保存4周效果不减。 4.1.2.2.样品量的选择与样品过滤:根据样品的污染程度，使用样液的量为100， 10，1，0.1或0.01mL。使用灭菌滤膜过滤样液，以能在滤膜上生长出20,100个菌落为宜。 5.2.3.接种与培养:将已滤过样液的滤膜紧贴在KF琼脂培养基表面上，膜下避免出现气泡。倒置平皿于36?1?培养48?2h。 4.1.2.4.粪链球菌群的计数与计算:粪链球菌群细菌在KF琼脂平板上的滤膜上形成暗红色至粉红色菌落，使用低倍大视野双目解剖镜或效能相当的其他光学仪器帮助计数。选择生长20,100个菌落的滤膜，根据所使用的样品量，算出该样品每克(毫升)中的粪链球菌群数。 4.1.2.5.确证试验:由于KF培养基有良好的选择性能，在KF琼脂平板上的滤膜上生长的红色或粉红色菌落，实际上都是粪链球菌群细菌。按下列程序作进一步确证试验:将滤膜上的典型菌落接种于脑心浸液琼脂斜面，置36?1?培养48?2h;用其培养物做过氧化氢酶试验，过氧化氢的浓度为3,。阳性反应者为非 ?0.5?培养48?h;链球菌群细菌。阴性反应者接种于脑心浸液肉汤，置45.5 同样方式接种一管胆盐肉汤(无菌10,牛胆液40mL加入60mL无菌脑心浸液配成)，置36?1?培养3d。在上列两种情况下生长者为粪链球菌群细菌。 4.1.3.平板计数法 .1.3.1.平板制备:按附录A(补充件)中A2或A4制备琼脂培养基，倾注平板4 前将融化的培养基于45,50?保温，保温时间不要超过4h。 4.1.3.2.接种与培养:取1mL适当稀释的样液加入90mm×15mm的培养皿内，倾入12,15mL已融化约45?的KF或PSE琼脂培养基，轻轻转动培养皿，使样液与培养基充分混合，让细菌均匀分散在培养基内。从样品稀释液制备至倾注平板时间不要超过20min。待平板凝固后倒置平皿进行培养:KF平板置36?1?培养48?2h;PSE平板置36?1?培养24?2h。 4.1.3.3.菌落计数及报告结果:粪链球菌群细菌在KF平板上形成暗红至粉红色菌落，边缘整齐。表面以下菌落常呈椭圆或晶体状;在PSE琼脂平板上形成带棕色环的棕黑色菌落。使用有适当光源的低倍大视野双目解剖镜或效能相当的其他光学仪器，对有30,300个菌落的平板进行菌落计数。按粪链菌群数,g(mL)报告结果。 若需进一步鉴定分离的粪链球菌，可参照附录C(参考件)进行。 5.来源: SN,T0475,95 附 录 A 培 养 基 (补充件) A1.叠氮化钠葡萄糖肉汤 牛肉浸膏 4.5g 胰蛋白胨或多胨 15.0g 葡萄糖 7.5g 氯化钠 7.5g 叠氮化钠(NaN) 0.2g 3 蒸馏水 1000mL 以上各成分混匀，不断搅拌加热溶解。用适当大小的试管分装，每管10mL，121?高压灭菌15min，灭菌后的培养基pH约为7.2。若制备双料浓度的叠氮化钠葡萄糖肉汤，可将上述配方中蒸馏水改为500mL。 A2.Pfizer肠球菌选择性琼脂(PSE琼脂) 蛋白胨 20.0g 酵母浸膏 5.0g 细菌学用胆汁 10.0g 氯化钠 5.0g 柠檬酸钠 1.0g 七叶甙(Esculin) 1.0g 柠檬酸铁铵 0.5g 叠氮化钠(NaN) 0.25g 3 琼脂 15.0g 蒸馏水 1000mL 灭菌后的pH为7.1。于45,50?保温培养基，从保温开始至倾注平板的时间不要超过4h。 A3.KF链球菌琼脂 3号胨或多胨 10.0g 酵母浸膏 10.0g 氯化钠 5.0g 甘油磷酸钠 10.0g 麦芽糖 20.0g 乳糖 1.0g 叠氮化钠 0.4g 琼脂 20.0g 蒸馏水 1000mL 将各成分加热溶解，用10,的碳酸钠调整pH值至7.2，121?灭菌15min，冷却至50,60?时加入无菌1,氯化三苯四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride)水溶液10mL。培养基于45,50?保温不要超过4h。倾注或移取4,5mLKF琼脂至(60mm×15mm)的皿中，若出现气泡可用火焰灼除。若使用盖合紧密的塑料皿(50mm×12mm)，可预先制成平板，置4,10?储存，4周内可使用。 A4.脑心浸液 小牛脑浸液(固体) 12.5g 牛心浸液(固体) 5.0g 胨 10.0g 葡萄糖 2.0g 氯化钠 5.0g 磷酸氢二钠 2.5g 蒸馏水 1000mL 灭菌后的pH值为7.4。 A5.脑心浸液琼脂 在脑心浸液中加入15.0g琼脂，灭菌后的pH为7.4。制成试管斜面备用。 附 录 B 1g样品中最可能数(MPN)表 (补充件) 使用三管法，接种量为0.1，0.01，0.001g(mL)。 表 B1 阳性管数 阳性管数 0.1 0.01 0.001 MPN 0.1 0.01 0.001 MPN 0 0 0 ,3 0 3 1 13 0 0 1 3 0 3 2 16 0 0 2 6 0 3 3 19 0 0 3 9 1 0 0 3.6 0 1 0 3 1 0 1 7.2 0 1 1 6.1 1 0 2 11 0 1 2 9.2 1 0 3 15 0 1 3 12 1 1 0 7.3 0 2 0 6.2 1 1 1 11 0 2 1 9.3 1 1 2 15 0 2 2 12 1 1 3 19 0 2 3 16 1 2 0 11 0 3 0 9.4 1 2 1 15 1 2 2 20 2 3 1 36 1 2 3 24 2 3 2 44 1 3 0 16 2 3 3 53 1 3 1 20 3 0 0 23 1 3 2 24 3 0 1 39 1 3 3 29 3 0 2 64 2 0 0 9.1 3 0 3 95 2 0 1 14 3 1 0 43 2 0 2 20 3 1 1 75 2 0 3 26 3 1 2 120 2 1 0 15 3 1 3 160 2 1 1 20 3 2 0 93 2 1 2 27 3 2 1 150 2 1 3 34 3 2 2 210 2 2 0 21 3 2 3 290 2 2 1 28 3 3 0 240 2 2 2 35 3 3 1 460 2 2 3 42 3 3 2 1 100 2 3 0 29 3 3 3 ,1 100 注:表内所列样品量如改为1，0.1，0.01g(mL)时，表内数字应相应降低10倍;如改为0.01，0.001， 0.0001g(mL)时，则表内数字相应增加10倍，其余可类推。 附 录 C 粪链球菌鉴定简图 (参考件) 样 品 KF琼脂 ? PSE琼脂 粉红色菌落 ? (带棕色环的棕黑色菌落) 在脑心浸液肉汤内45?培养2d和 在10?培养5d的生长物，确证为 过氧化氢酶阴性 在45?和10?生长 ? ? 仅在45?生长 在含6.5,NaCl，pH9.0的脑心浸液肉汤内生长 ? 牛链球菌和马肠链球菌 ? 牛奶中0.1,亚甲基蓝 淀粉水解试验 还原试验 ? 阳性 阳性 阴性 肠球菌群 暂定Q菌 乳糖发酵试验 (鸟链球菌) 仅产酸 不变 KTOTTC还原和D , 山 淀粉水解试验 2c2 梨醇及甘油醇发酵试验 牛链球菌 马肠链球菌 (来源于畜禽) 阳性 阴性 阳性 阴性 ? ? ? 粪链球菌及其亚种 发酵试验 非典型粪 链球菌 石蕊牛奶胨化试验 (来源于植物) 明胶水解试验 L, 阿拉伯糖 ? ? 阳性 阴性 阳性 阳性 ? ? 阴性 粪链球菌和 屎链球菌 粪链球菌 粪链球菌产 粪链球菌 液化亚种 酶亚种 液化亚种 肠球菌 ? (来源于昆虫) (来源于温血动物) 溶血试验 阳性 ? 阴性 粪链球菌 ? 产酶亚种 粪链球菌