【doc】大鼠肝实质及非实质细胞分离和质量检测

【doc】大鼠肝实质及非实质细胞分离和质量检测 大鼠肝实质及非实质细胞分离和质量检测 中国药理学通报ChinesePharmacologicalBulletin2000Jun;16(3):341,3?341 fr; 大鼠肝 中国图书分类号R一332;R322 R446.1 文献标识码A文章编号10011978(2000)03—0341(13 摘要目的探索分离肝实质细胞及非实质细胞的合理条 件.方法应用胶原酶/蛋白酶E梢化分离和低速离心技 术.以细胞活率,细胞产量和细胞纯度等指标检-删细胞质量 结果在37?0.5g?L的胶原酶作用30min,800r? min|1离心条件下,肝实质细胞产量(98×10?4×10- L),纯度(97%?2%)和活率(>9O%)最好.胶原酶和蛋 白酶E合用,肝非实质细胞产量最高(28.6×10?3.7×10 ? L..),Kupffer细胞纯度合理(16.0%13.596),且Kupffer 细胞含量符合体内正常分布.结论本实验方法分离细胞 对于进一步研究肝实质,尤其肝非实质细胞功能有实际意 义 关键词肝实质细胞;肝非实质细胞;细胞分离;细胞产量; 细胞纯度 以往,肝实质细胞和非实质细胞分离多采用灌 流法[,而进一步纯化非实质细胞国外应用了淘析 1999.11.01收稿.1999.12.25修回 湖北省教委资助项目.N.9501 作者茼彳r:张燕华.女,31岁.硕士.从事生化药理研究; 彭仁臻.女,65岁.教授,博士生导师.教研室主任,从事生 化药理研究 杂,淘析器设备昂贵或分离剂来源不易而难广泛 应用.本文在现有实验条件下,用不同条件,方法分 离肝实质细胞和非实质细胞,以细胞活率,细胞产量 和细胞纯度等指标检测细胞质量,探索分离两类细 胞的台理条件. 1材料和方法 1.1动物Sprague—Dawley0大鼠,体重150,200 g. 1.2试剂I型胶原酶(collagenaseI),3一甲基胆蒽 (3-methylch0lanthrene,3-MC),异柠檬酸(isocitric acid),异柠檬酸脱氢酶(isocitricaciddehydroge— nase),7乙氧异唑(7ethoxyresorufin),异吧唑 (resor~in)为Sigma公司产品.蛋白酶E(pronase E)为Serva公司产品.其它为国产分析纯. 1.3细胞分离大鼠乙醚麻醉,门静脉插管,用20 mlD-Hank液冲洗肝脏至灰白色,摘取肝脏用 Hank液漂洗3次,剪切成1,2m大小. 13.1实质细胞分离肝组织用0.5g?LI1胶原 酶,37?水浴消化30min,用200目尼龙网过滤,滤 液在0,6?条件下分别以200,500,800和1500r? min离心15min.弃上清,用D-Hank液漂洗.重 复3次.末次弃上清,细胞以磷酸缓冲液重悬. Amodelofcarbontetrachloride-inducedhepaticfibrosisinmice XUJian—Ming,XUShu—Yun,ZHANGYun—Fangg.MEIQiao2,WUJi—Feng (DeptofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity; .InstituteofClinicalPharmacology,AnhuiJWedicalUniversity,m230022) ABSTRACTA1MToestablishamodelofcarbon tetrachloride-inducedhepaticfibrosisinmice. METHoDSChronicadminstrationof20%carbon tetrachloride(cch)wancarriedoutinKun—Ming micefor3months,andthenthechangesofhepatic pathologyandindexofhepaticbiochemistryobserved asanintervalof30daysbetweenexperimentsrespec tively.RESULTSThescoreofhepaticfibrosisand thecontentofhepatichydroxyprolineweregradually jncreased(P<O.O5,O.01).ThecontentDfmolon— diadehydeinlivermonogenatesandtheactivityof serumalaminotransferaseweresignifcantlyhigher thanthatofcontrolgroupsinthreeobservedstages (P<0.O1)either,buttherateofalbumininserum wassignifcantlyreducedonlyattheendstageofhep— aticfibrosisinmiceinducedbyCC14(P<0.05) CONCLUS10NChronicadministrationofcchto micecaninducehistologicallyobservableliverfibrosis withcharacteristicstagesofhepaticfibrosis KEYWORDSanimalmodel;liver;mice;carbon tetrachloride 342,中国药理学通报ChinesePharmacologicalBulletin2000Jun;16(3) 1.32非实质细胞分离采用3种分离方法.胶 原酶蛋白酶E法:用上述胶原酶消化所得全肝细胞 悬液,以Ig?L蛋白酶E(pH7.4)37?水浴消化 30min后,I500r-min离心15minX3胶原酶 法:肝脏碎片用0.5g?L胶原酶37?消化60min, 500r?min离心7min后,收集上清液以1500r- min离心15min×3.蛋白酶法:肝脏以2g-I 蛋白酶E灌注2min.'肝脏碎片以1g?L蛋白酶 E(pH74)37?温育60min.由于肝实质细咆对蛋 白酶E特别敏感而全部被分解破坏,只剩下肝非实 质细胞J. 1.4细胞质量检测细胞活率采用拒染实验法. 计算能够排除0.6%台盼蓝而不被染色的活细胞的 百分率.细胞产量用血球计数板计数.细胞纯度包 括肝实质和非实质细胞纯度.前者以肝实质细胞百 分含量表示,后者则以不同细胞的百分组成表示. 不同细胞通过组织化学法鉴定.Kupffer细胞以过 氧化物酶染色鉴别.淋巴细胞用非特异性脂酶 染色中的六偶氮付品红醋酸萘脂法鉴别_5J.为 进一步证实非实质细胞中不含有实质细胞,采用以 下方法:Sprague—Dawley大鼠随机分成两组.正常 对照组按照胶原酶一蛋白酶方法分离全细胞悬液. 3-MC组先常规分离全细胞悬液.后加入经过3一MC 诱导(大鼠腹腔注射3-MC25mg-kg一,qd×3)具 有高的细胞色素P4501A1酶活性的20×10个肝 实质细胞.两组在同等条件下,经过30min的蛋白 酶E作用后得到的非实质细胞.比较两组的7一乙 氧异曝唑一O一脱乙基酶活性. 15酶学分析7一乙氧异曝唑一O一脱乙基酶(7一 ethox)rresorufin-O-deethylase,EROD)活性依据荧光 法测定.反应总体积为1.0ml,含Tris—HC150 mmo|-L_'(pH7.8),MgC122.5mmo|?L-.,KCl5O mm.卜L一,NADPH再生系统(NADP0.4mmol- L一,异柠檬酸10mmol?LI1和异柠檬酸脱氢酶0.6 u),7一乙氧异曝唑2t~mol?L',牛血清白蛋白1.2g? L,,反应时间30min,甲醇2.5ml终止反应,以异 曙唑为 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品,在岛津RF-540荧光分光光度计上 测定上清液的荧光强度,EX530nm,EM586nm. 酚试剂法测定蛋白含量. 2结果 21不同离心速度对肝实质细胞产量及纯度的影 响肝细胞悬液过氧化物酶染色后Kupffer细胞呈 棕褐色,肝实质细胞不着色,以此计算肝实质细胞纯 度.如表1所示,肝实质细胞产量随离心速度的上 升而增加,细胞纯度随着转数的上升而下降.其中 s0Or?min情况下,细胞产量(98×10?4×109- L)增加明显(P<0.05)而纯度下降(97%?2%) 较少.细胞活率均>90%. Tab1lnfluenceofdlfferenlcentrtfegatlonSpeedoB. theyieldandpurltyofI~renchymalcellsfromrats P<005.一P<001w200r?叫ngroup 2.2不同分离方法对肝非实质细胞产量和纯度的 影响非实质细胞悬液用过氧化物酶染色.Kupffer 细胞呈棕褐色,而内皮细胞和淋巴细胞不被染色. 经非特异性脂酶染色,淋巴细胞染色为阴性,不着 色,核复染苏木精,着色呈淡绿色,而其它几类细胞 染色呈阳性.有弥漫性棕色颗粒分布.通过染色结 果镜下计算非实质细胞的组成百分率,再结合总体 细胞产量计算几类细胞的实际含量.可见胶原酶一 蛋白酶法得到细胞产量最高,其中KuDffer细胞相 对含量(16.0%?3.5%)接近肝细胞的正常分布,且 Kupffer细胞的实际含量最高.细胞活率均>90% (表2). 2.3非实质细胞EROD活性EROD是肝实质细 胞中细胞色素P4501A1的标志酶,3-MC是EROD 的选择性诱导剂.由表3可见,经过3一MC诱导的 肝实质细胞的EROD活性较对照组活性增高2O倍 (P<0.01),说明3-MC诱导肝实质细胞细胞色素 P4501A1酶成功.3一MC组非实质细胞EROD活 Tab2lnlluen~mseffeclsofdiffereu!isolatt~methodsantheyieldandpurltyofnonparenchym alce-bfromrats 'P<0.05wc.】【【Iaspmngroup 中国药理学通报ChinesePharmacotogicalBulletin2000Jun;16(3).343 (EROD)aetb'ities Inpa~nehymalandnonparenchyrealc~llsfromrat' Group ER0D/nmol?min NonparenchyrnalcellsParenchynla]cells .P<001coatrolgroup 性与正常对照组差异无显着性(P>0.05).表明经 过30min的蛋白酶E温浴,肝实质细胞破坏完全, 非实质细胞纯度高. 3讨论 本文制备肝实质细胞采用剪切法加胶原酶,剪 切法虽可能对组织有一定损伤.但与肝灌流法比较, 操作简便易行,而合用胶原酶可使细胞进一步分散. 在细胞分离中,常期望获得较高纯度的细胞.离心 法是通过比重不同进行分离.肝实质细胞由于体积 大(直径约20--30/zm),比重大,在较低的转速下已 开始沉淀,而后随着转速的增加,比重小的细胞如 Kupffer细胞也被沉淀.因此在1500r-minI1时. 细胞产量高,但细胞纯度大为降低.因此为兼顾上 述两类指标,我们认为理想分离条件为:0.5g-LI1 胶原酶I,37?消化30min,800r-min离心15min x3.肝非实质细胞是由内皮细胞,Kupffer细胞和 淋巴细胞组成.由于肝Kupffer细胞功能的多样性 和复杂性成为研究的热点.单独用蛋白酶E,Kupf— fer细胞的纯度最高.已知蛋白酶E对肝实质细胞 破坏极强,利于Kupffer细胞的分离,并在长选8h 的蛋白酶E温浴下,细胞性状良好.但因未使用胶 原酶.肝细胞分散不全而使细胞总产量降低.单使 用胶原酶,可使细胞分散理想产量居中,但仅靠提高 离心速度,并未使Kupffer细胞的含量增加.胶原 酶一蛋白酶合用,肝非实质细胞总产量最高,且Kupf— fer细胞实际含量最高,相对含量l6%符台生理条 件下的正常分布.遗对进一步研究Kupffer细胞提 供_『有利条件.EROD活性结果表暇在lg-L蛋 白酶E作用30min,肝实质细胞破坏完全,表明蛋 白酶E的浓度和作用时间合理.本文肝实质细胞 和非实质细胞的分离来源于同一个体,不同于 Steinberg等人采用不同大鼠个体以便获得高产率 的非实质细胞,相对减少了个体差异并使系统误差 减少. 参考文献 1GlattFIR,BillingsR.PlattKLetalImprovementoftheco~la— tioaofbacterialmutageNchywithcarcIn.gen1c】tyofbenzo(a)pyrene adfour.f】t5majormetab.lltesbyactivationwithintactlivercl1s instm~dofl1homoge~teC?Res1981;41:270,7 2DeL?AMBareldsKI.DeZ~gerR.Krl(I]kDLPrimarycul一 【…ofPndothelialcellsoftheratl…Ceand丁如Res.1982; 223—201,】5 3BergT.BomanD.KnookDLDistributionoflysosomalenes betweenpar~nehymalandKupffercellsofratliverBinchlmB— i,ay~Acta,1973;321:585,96 4SteinbergP.LafranconiWM.WolfCRXenobioricmetat~一 lizinge~ymesaren.crestrictedtoparenchyrnalcellsinratliver. MolPharmaco1.1987;32:463,70 5馥启渡主编宴甩稿理特碡染色扣技术第2版.广州:广东高 等教育出版杜,1989:100,3 Isolationandcharacterizationofhepaticparenchymal andnonparenchymalcellsfromrats ZFL%NGYah—Hua,PENGRen—Xiu,ZHANGZhi—Shan,WANGHui,KONGRui (DeptofPharmacology,HubeiMedh'alUniversity,Wuhan430071) ABSTRACTAIMToexploretheappropriatesepa— ratingconditionoftheparenchyma1andnonparenchy— malcells.METHODSTheeel1viability.yieldand purityweremeasuredbydifferentseparatingmeth— ods.RESULTSParenchyma1cellswereobtained with800r?minI1and37?for40mln.Boththeeel1 yield(98×10?3.5×10-L一1andthecellpurity (97%?2%)werehigher~theeel1viabilitywasmore than90%.Comparedwiththeothermethods.non— parenchyma1cellsobtainedwithcombinedcollage— nasepronasemethodshadthehighestcellyield(286 x10?3.7×10-L).eventhepercentageof Kupffer(16%?3.5%)wasreasonableandaccorded withnorma1distribution.CONCLUSIoNThese methodsareverypracticaltodetectthefunctionsof abovetwotypesofcells,especiallythenonparenchy— ma1cells. KEYWORDShepaticparenchymalcell;noll parenchymalcells;cellisolation;cellyield;cellpurj— ty