SRDP实验流程

SRDP实验流程SRDP实验流程一、实验仪器: 高速台式冷冻离心机、匀浆机、超声波粉碎仪、漩涡搅拌器、电泳装置、荧光检测系统二、实验药品及试剂: 三羟甲基氨基甲烷(Tris-base):购自Biotech 三羟甲基氨基甲烷马来酸酯(Tris-maleate):购自ACROS ORGANICS 十二烷基硫酸钠(SDS):购自Decent Biotech 山梨糖醇(D-Sorbitol):购自Sigma 氨基己酸(6-Aminocaproic acid):购自Sigma PMSF):购自Amresco 苯甲基磺酰氟(...

SRDP实验流程一、实验仪器: 高速台式冷冻离心机、匀浆机、超声波粉碎仪、漩涡搅拌器、电泳装置、荧光检测系统二、实验药品及试剂: 三羟甲基氨基甲烷(Tris-base):购自Biotech 三羟甲基氨基甲烷马来酸酯(Tris-maleate):购自ACROS ORGANICS 十二烷基硫酸钠(SDS):购自Decent Biotech 山梨糖醇(D-Sorbitol):购自Sigma 氨基己酸(6-Aminocaproic acid):购自Sigma PMSF):购自Amresco 苯甲基磺酰氟(Phenylmethylsuulfonyl fluoride， Dig):购自Sigma 毛地黄皂苷(Digitonin，甘油(Glycerol)购自:Decent Biotech 丙烯酰胺(Acrylamide，Acry):购自Decent Biotech N,N亚甲基双丙烯酰胺(N,N-methylene-bisacrylamide，Bis):购自Sigma 甘氨酸(Glycine):购自Decent Biotech 脱氧胆酸钠(Sodium deoxycholate，DOC):购自Sigma N,N,N,N-四甲基二乙胺(N,N,N,N-tetramethyl ethylenedia mine，TEMED):购自Decent Biotech 过硫酸铵(Ammonium persulfate，APS):购自SCR沪试考马斯亮蓝R250(Coomassie brilliant blue R250) 无水乙醇、冰乙酸、丙酮、盐酸均由国内其他厂家生产。三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)由Tris-base与盐酸调配至所需浓度三、实验步骤: 1.含水量的测算将采集的样品解冻，混匀。以锡纸折叠成杯，称重G1，取约1g样品于锡纸杯中，称鲜重G2。将锡纸杯及样品放入烘箱，100?下烘烤24h以上，取出冷却至室温，称重G3。含水量:[1-(G3-G1)/(G2-G1)]*100% 2.叶绿素蛋白复合物的提取取约1g新鲜样品解冻，称重。加入5。00mL Buffer A(2mM Tris-maleate，0.1M D-Sorbitol，0.5mM 氨基己酸，1mM PMSF)，于25mL小烧杯中计时匀浆(分别设定匀浆时间为20s、40s、60s)。将匀浆液转移至50mL离心管中离心，离心机设置:转速4400转，温度4?，时间20min。离心出的上清液倒出，加入丙酮稀释至20mL，留待荧光法定量分析。向离心得到的沉淀中加入2.00mL Buffer B(2mM Tris-maleate，20g/L Dig)，计时进行超声波粉碎(分别设定超声时间为20s、40s、60s)，之后将离心管置于漩涡搅拌器上搅拌40s。将混合液放入离心机中离心，离心机设置:转速4400转，温度4?，时间20min。将离心出的上清液在同样条件下再次离心。向离心出的上清液中加入1.00mL Buffer C(60% 甘油，0.5M Tris-HCl[pH=6.8])，取120μL准备电泳分离，其余以丙酮稀释至25mL，再取其中1mL稀释20倍留待荧光法定量分析。 3.丙酮直接提取法提取叶绿素取约1g新鲜样品解冻，称重。加入5.00mL丙酮，匀浆40s，离心，离心机设置:转速5000转，温度4?，时间10min。离心后上清液保留，沉淀中加入5.00mL丙酮，同样设置下再次离心，离心后上清液与上一步上清液混合，沉淀重复此步。将三次离心的上清液混合后，以丙酮稀释至25mL，再取500μL以丙酮稀释至20mL，留待荧光法定量分析。 4.电泳分离使用聚丙烯酰胺凝胶电泳对样品提取液进行分离分析。实验尝试两种电泳胶配方(如下表 ) 胶1 胶2 堆积分离堆积胶分离胶胶胶 10.26%(10% 浓度 3.9%(3.8% Acry) 4% 10% Acry) 1.32m3.30m30%Acry:Bis(37.5:1) 1.30mL 3.42mL L L 2.52m0.5MTris-HCl,pH=6.8 7.5mL — — L 2.50m1.5MTris-HCl,pH=8.8 — 0.83mL — L 5%DOC — 1.00mL — — 6.00m4.05m高纯水 1.14mL 4.69mL L L TEMED 5μL 5μL 10μL 5μL 10%APS 50μL 50μL 50μL 50μL 总计 10mL 10mL 10mL 10mL 两种配方及相应缓冲液、实验条件参考不同厂家和胶1采用的电泳缓冲液配方为: 0.3% Tris-base, 1.44% Glycine, 0.05% DOC 胶2采用的电泳缓冲液配方为 25mM Tris-base, 192 mM Glycine, 0.1% SDS 胶1采用电流控制，堆积胶20mA，分离胶40mA 胶2采用电压控制，堆积胶50V，分离胶200V 当蛋白前沿与胶板底距离约为1厘米时停止电泳，取出胶板。撬开胶板，使用考马斯亮蓝染液(40% 无水乙醇，10% 冰醋酸，0.9%考马斯亮蓝)染色。染色后使用脱色剂(40% 无水乙醇，7% 冰醋酸)脱色。拍照。

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