[管理]MS培养基及配制注意事项

[管理]MS培养基及配制注意事项 一、MS培养基母液的配制 母液 浓缩 母液 配制1升编种成 分 规定量 倍数 称取量体积培养基吸 (mg) (ml) 取量定容 号 类 大KNO3 1900 10 19000 量NH4NO3 1650 10 16500 1000 1 元 100 MgSO4?7H2O 370 10 3700 素 KH2PO4 170 10 1700 2 CaCl?2H2O 440 10 4400 1000 100 2 MnSO4?4H2O 22.3 100 2230 ZnSO4?7H2O 8.6 100 860 3 微 H3BO3 6.2 100 620 量1000 10 KI 0.83 100 83 元Na2MoO4?7H2O 0.25 100 25 素 CuSO4.5H2O4 0.025 100 2.5 CoCL2.6H2O 0.025 100 2.5 4 铁Na2-EDTA 37.3 100 3730 1000 10 盐 FeSO4.4H2O 27.8 100 2780 甘氨酸 2.0 100 100 5 有 盐酸吡哆醇 0.5 100 25 机500 10 盐酸硫铵素 0.1 100 5 物 烟酸 0.5 100 25 6 肌酸 100 100 5000 500 10 注意:1(大量元素按照使用时高10倍的数值称取，分别将各种化合物称量后，除CaCl?2HO单独配制外，其余化合物混合在500ml烧杯中加适量蒸馏水溶解，用玻璃棒搅22 拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，置小口瓶中保存，贴上标签注明化合物名称(或编号)，浓缩倍数，配制日期和配制者姓名，CaCl?2HO配制同上置于另一小口22 瓶中。 2(微量元素母液的配制 按要求浓缩100倍的数值称取，分别将各种化合物称量除铁盐(FeSO?7HO和42Na-EDTA.2HO)作为一组单独配制外，其余化合物可混合置于烧杯内加少量蒸馏水溶解后，22 定容在1000ml容量瓶中，置小口瓶中保存，贴上标签。 3(铁盐配制将FeSO?7HO和Na-EDTA.2HO分别溶于450ml蒸馏水中，加热，(很重要)4222 不断搅拌，溶解后，两液混合，调PH至5.5加水定容至1000ml，置于小口瓶中，贴上标签。 4(有机物母液配制，按母液要求浓缩50倍，除蔗糖按3%单独临时称量外，其余分别称量后，溶解，定容在500ml容量瓶中，置于小口瓶中保存，贴上标签。 (母液最好在2~4?的冰箱中贮存，特别是有机类物质，贮存时间不宜过长，无机盐母液5 最好在一个月内用完，如发现有霉菌和沉淀产生，就不能再使用。 1( 制备母液和营养培养基时，所用蒸馏水或无离子水必须符合 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 要求，化学药品必须是 高纯度的(分析纯)。 2( 称量药物采用高灵敏度的天平，每种药品专用一药匙。 (生长调节剂母液配制: 为了操作方便，节约时间，生长调节剂也可如同配制母液一样，先配成原液，这样配制培养基时只要稍加计算，按需要量取即可。 不同药品在配制时若不溶于水，可用少量不同的溶剂先溶解，萘乙酸(NAA)，吲哚乙酸(IAA),赤霉素(GA)，2，4-D等生长素和玉米素(ZT)可先用少量95%酒精溶解，然3 后加水，如溶解不完全再加热。激动素(KT)和6-苄基嘌呤(BA)可溶于少量1mol/L的盐酸中，叶酸需用少量稀氨水溶解。 称取50mg生长调节物质，溶解后，在100ml的容量瓶中定容，配制的母液每毫升则含有生长调节物质0.5mg，配制后一般要求在低温(0~4?)保存，配制培养基时如每升(1000ml) ml母液即可。 需添加的生长调节剂物质为0.5mg时，则取1 二、培养基配制和灭菌 一(养培养基配制程序 (一).母液吸取量的计算 配制培养基的升数 公式1:母液吸取量= 母液体积(CC)×—————————— 母液浓缩倍数 培养基要求的含量 公式2:母液吸取量= ———————————(各种生长调节剂) 母液每CC的含量 (二) 各种母液按顺序编号排列 A. 大量元素;B.CaCl.2HO; C.微量元素 ;D.铁盐; E.有机物; 22 F(生长素萘乙酸(NAA):配制0.5mg/ml的NAA称取50mg ， NAA用少量95% 酒精溶解后加蒸馏水定容至1000ml;G..细胞分裂素、激动素(KT)配制0.5mg/ml的KT 称50mgKT用少量1N HCL溶解后,加蒸馏水定容至100ml。 (三) 配制培养基(1000ml) 1. 琼脂: 称取5~7g琼脂，加入300ml蒸馏水，加热溶解直至完全溶解为止. 2. 蔗糖3%用质量较好的白糖代替，称取30g白糖，溶于溶有琼脂的300ml蒸馏水中。 3. 各种母液的吸取(培养基1L) (1) 用50ml量筒量取大量元素母液(A)和CaCl?2HO母液(B)各100ml22 (2) 分别用10ml移液管或吸管吸取微量元素(C)，铁盐(D)母液各10ml (3) 用10ml移液管或吸管吸取有机物(H)10ml 4) 移取激素 ( 将上述溶液全部混合于琼脂与蔗糖溶液中，混合均匀后，加热至80?左右，用酸度计或精密PH试纸测定培养基的PH一般要求5.8~6.0，过酸过碱则用1N NaoH和1N HCL调整。 二(分装:用一个接有胶管的分装器趁热装培养基，1000ml培养基分装到25-30个三角瓶中，每个三角瓶约30ml左右(一般占试管、三角瓶容量1/4~1/3左右)注:培养基勿碰瓶壁。 三. 包装:分装好的三角瓶用封口膜包扎好，标明培养基代号即可进行灭菌。 用具清理和洗涤:各种母液按原位置摆整齐，用过的量筒，移液管、烧杯、铝锅等用水洗涤干净，然后按次序放回原处。 三、高压蒸汽灭菌锅的使用方法 具体操作步骤: 1. 高压锅放水至平把架; 2. 把包扎好的培养基装入高压锅; 3. 盖上热压锅盖,上紧螺帽(注意对角拧紧螺帽)关上气阀和安全阀. 4. 然后接通电源. 5. 压力计升至0.05MPa时，打开放气阀,排除冷空气(此步很重要)。 6. 排除冷空气后,关闭放气阀，待压力升到0.11MPa位置时，开始计算灭菌时间，具体方法:当压力锅指针升至0.12MPa时，关闭电源，待指针下降至0.11MPa时接通电源，不断重复此操作过程，维持20分钟。 7. 灭菌时间达到20分钟后，除去电源，打开放气阀(注意要逐渐放气)待高压锅内的空气完全排除后，打开热压灭菌锅盖(注意对角扭松螺帽)稍待冷后再把培养基取出。 8. 经过灭菌的营养培养基不宜放置太长，应尽早使用，但为了在使用前能检查培养基有无微生物污染，可将培养基置于25?下保存4天，如果培养基需要贮存较长时间，可在4?低温下保存。 灭菌高压锅有大型卧式、中型立式、小型手提式等多种型号和规格，无论哪种型号，操作的步骤都很相近。 进水?放进培养基?盖紧锅盖?关上放汽阀?检查安全阀?接上加热源?待压力升至0.05MPa时排锅内冷空气，关上放气阀?0.11MPa(121?)下灭菌20~25分钟，保持稳定压力?除热源?逐渐打开放气阀?锅内空气排除完后?开放锅盖?稍冷后取出培养基。 四、无菌操作技术 (一)植物材料表面——消毒剂灭菌 从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带入培养基， 便会造成培养基污染。因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做接种。 1.接种步骤: 第一步:清理材料??流水冲洗??加入吐温(或洗衣粉)清洗 ??自来水冲洗 第二步:对材料的表面浸润灭菌 : 70%酒精浸10-30秒??无菌水 第三步:灭菌剂处理?? 0.1-1%升汞5-8 min(或其他灭菌剂) 第四步:无菌水进行冲洗 注意事项: ,.灭菌剂一般要临时配制，现配现用(升汞可以短期储存( ,.对去除较容易的灭菌剂灭菌后无菌水冲洗,-,次，升汞一般,-,次，每次不少于,min ,.灭菌时要轻轻的搅拌，消除气泡，使消毒更彻底( ,.灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止。 ,.灭菌液要充分浸没材料 2.无菌操作可按以下步骤进行: (1)在接种3天前用甲醛熏蒸接种室，并于接种前3小时打开其内紫外线灯进行杀菌; (2)在接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯; (3)接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等; (4)上工作台后，用酒精棉球搽拭双手，特别是指甲处。然后搽拭工作台面; (5)先用酒精棉球搽拭接种工具，再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干; (6)接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等; 2材料吸干后，一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的切割。(如叶片切成0.5cm的小块;茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含1-2片叶原基)在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。 (7)接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外线灯灭菌30分钟，若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。 常用植物激素 类别 名 称 缩写词 分子量 使用浓度范围 母液配制 说 明 生长素通常 2，4,二氯苯氧乙酸 2，4,D 221.0 0.001,10mg/L IAA易被植物生 细胞所氧化。用NaOH溶 α,萘乙酸 NAA 186.2 0.001,10mg/L 长 液滴至溶解故培养基中很素 成溶液。 少单独使用。 吲哚,3,乙酸 IAA 175.2 0.001,10mg/L 能溶于乙醇 吲哚,3,丁酸 IBA 203.2 0.001,10mg/L 分裂素通常玉米素不耐 6,苄基氨基嘌呤 BA 225.2 细 能溶于稀热，不能高压6,糠基氨基嘌呤 KT 215.2 胞 灭菌。 NaOH，含水分 乙醇或稀盐N,异戊烯氨基嘌呤 ZT 219.2 裂 酸 (玉米素) 赤霉素 能溶于乙醇 不耐热不能高 GA 346.4 3 赤 压灭菌在愈伤霉 组织和悬浮培素 养物的启动和 保持生长时才 需要有时小植 株再生时也需 要 四、常用药品的配置方法 1.1mol/L HCl的配制:根据盐酸的密度37%盐酸溶液的密度为1.19克/毫升，假设要配制1000ml 1mol/L HCl，则需要盐酸的物质的量为1mol，所以需要量取37%的盐酸为1*36.5/37%/1.19=82ml 2.1mol/L的NaOH的配制:称40gNaOH，然后融于1000ml的蒸馏水中。(定容到100ml) 3.95%的酒精配制成75%的酒精:用量筒量取750ml的95%酒精加入200ml的蒸馏水即可得到75%的酒精。 如果用无水酒精配制75%的酒精，则量取750ml的无水酒精，再加水250ml。 4.0.1%的升汞配制:先称取1克升汞粉末，然后用蒸馏水溶解最后定容到1000ml。 5. 1mg/ml的2.4-D的配制:称取0.1g2.4-D，用少量1mol/LnaOH或酒精助溶，然后定容到100ml。 6.1 mg/ml的6-BA的配制:称取0.1g6-BA，用少量1mol/L HCl或1mol/LNaOH助溶，然后定容到100ml。 7.0.5mg/ml的NAA的配制:称取0.05gNAA，用少量95%酒精助溶，然后定容到100ml。