Smad2基因在肺癌组织和细胞中的表达特点

卢其香，辛 勇，陈 辰，杨 冬，孙立柱

(1.徐州医科大学附属医院，江苏 徐州 221006；2.江苏省肿瘤医院，江苏 南京 210018；3.徐州医科大学附属沭阳医院，江苏 沭阳 223600)

肺癌发病率和死亡率位居全球首位，也是我国发病率和死亡率第一的恶性肿瘤[1].肺癌对放疗和化疗的敏感性较差，且复发、转移风险高，多数患者就诊时已处于中晚期，错失了最佳治疗时机[2]，因此，探寻早发现、诊断和治疗肺癌的生物标志物具有重要意义.Smad2基因是哺乳动物转化生长因子-β(TGF-β)信号传导通路的下游信号因子[3]；既往研究[4]显示：Smad家族基因与肿瘤的发生、发展密切相关，其中Smad1、Smad8介导哺乳动物的中枢神经发育；Smad4、Smad7缺失会促进肿瘤细胞的迁移和侵袭[5-6]；Smad4可能参与胰腺癌、胃癌等恶性肿瘤的发生与发展，且在不同肿瘤中的作用存在差异[7-8]，因此，需要进一步深入研究.目前，关于Smad2基因在肺癌中作用的研究十分少见.本研究探讨了Smad2基因在肺癌组织和细胞中的表达特点及意义，旨在为肺癌的早发现、早诊断、早治疗提供新的生物学标志物.

1 资料与 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载

1.1 一般资料

选取2015年1月—2016年12月徐州医科大学附属医院收治的肺癌患者128例，其中，男68例，女60例；年龄52～76岁，平均(64.81±6.35)岁.患者均接受手术治疗，收集肺癌组织，并经病理学检查证实，同时取与肿瘤边缘相距5 cm以上的癌旁正常组织.组织样本取出后立即放入液氮中速冻，之后存放于 80 ℃超低温冰箱中.本研究经医院伦理委员会批准同意后进行组织标本采集(伦理批号：LLP-2015012)，患者均签署知情同意 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf .

1.2 细胞株及主要试剂、仪器

人正常肺上皮细胞BEAS-2B、人肺癌细胞A549(上海通派生物科技有限公司)；胎牛血清、RPMI-1640培养基(上海抚生实业有限公司)；鼠抗人Smad2单克隆抗体、鼠抗人GAPDH单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG(上海铭修生物科技有限公司)；Trizol试剂(上海杰美医药科技有限公司)；CCK-8、Transwell小室(北京优尼康生物科技有限公司)；3-甲基胆蒽(武汉易泰科技有限公司).7500型实时荧光定量PCR仪(赛默飞公司，美国)；IX53光学显微镜(奥林巴斯公司，日本)；多功能酶标仪(北京悦昌行科技有限公司).

1.3 方 法

1.3.1 细胞培养与转染

将人正常肺上皮细胞BEAS-2B、人肺癌细胞A549置于细胞培养皿中，使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，于37 ℃下5% CO2培养箱中培养，收集对数生长期细胞用于实验.取对数生长期BEAS-2B细胞，使用10 μg/L的3-甲基胆蒽连续染毒培养至第10代、第20代、第30代、第40代用于实验.取对数生长期A549细胞，Smad2过表达组A549细胞转染Smad2过表达质粒，Smad2低表达组转染Anti-Smad2质粒，对照组仅常规培养.

1.3.2 RT-PCR检测肺癌组织和细胞中Smad2 mRNA表达

取300～400 mg肺癌组织，加入500 μL裂解液进行组织匀浆.Trizol试剂提取组织匀浆和人正常肺上皮细胞BEAS-2B、人肺癌细胞A549的RNA，反转录得到cDNA，进行实时荧光定量PCR扩增.引物设计由重庆波尔生物科技有限公司设计、合成，Smad2正向引物：5′-CCGGTAGACCGTGTCCCTAG-3′，反向引物：5′-AAGCATTGGACCTACGACCA-3′；内参GAPDH正向引物：5′-CGGACCTAT CGTTGCA TGTAC-3′，反向引物：5′-TAGCACGCACTGTAATT CCTC-3′.反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 60 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共45个循环.相对定量法测定Smad2基因表达水平.

1.3.3 Western blot检测肺癌组织和细胞中Smad2蛋白表达

取300～400 mg肺癌组织，加入500 μL裂解液进行组织匀浆.RIPA裂解液提取组织匀浆和人正常肺上皮细胞BEAS-2B、人肺癌细胞A549的蛋白，BCA法测定蛋白浓度，根据蛋白量加入适量的10×DNA Loading Buffer混合均匀，加热变性，-20 ℃保存.电泳分离蛋白并转至PVDF膜，BSA室温下封闭1 h，滴加鼠抗人Smad2单克隆抗体(稀释倍数1∶400)，鼠抗人GAPDH单克隆抗体(稀释倍数1∶1 000)；4 ℃过夜，滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG(稀释倍数1∶2 000)；ECL显影，使用Image J软件读取各条带的灰度值，计算Smad2蛋白的相对表达量.

1.3.4 资料收集与随访

收集肺癌患者的性别、年龄、吸烟史、T分期、N分期、M分期、肿瘤分期.术后对患者进行为期5 a的随访，记录生存时间、3 a生存率、5 a生存率.以Smad2 mRNA表达的中位数为界值，将肺癌患者分为Smad2低表达组和过表达组进行比较 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 .

1.3.5 细胞增殖实验

分别将对照组、Smad2过表达质粒组、Smad2低表达质粒组A549细胞均匀铺于96孔板中，每孔加入细胞培养液100 μL，细胞计数20个/μL，每组设置12个复孔，培养72 h后更换为含有10%CCK-8的细胞培养液，37 ℃避光孵育1 h，应用多功能酶标仪读取光密度值.

1.3.6 Transwell细胞迁移和侵袭实验

细胞迁移实验：对照组、Smad2过表达质粒组、Smad2低表达质粒组A549细胞使用含1%胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬，取1×105个A549细胞加入Transwell细胞小室中，下层孔室中加入含1%胎牛血清的RPMI-1640培养基，于37 ℃下5% CO2培养箱中培养12 h；擦除Transwell细胞小室中的剩余细胞，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫染色，显微镜下计数.

细胞侵袭实验：基底胶与不含胎牛血清的RPMI-1640培养基按1∶15比例混合，然后取100 μL加入Transwell细胞小室中，加入1×105个A549细胞，其余步骤同迁移实验.

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 Smad2基因在癌旁正常组织和肺癌组织中mRNA和蛋白表达水平

肺癌组织中Smad2的 mRNA表达水平明显高于癌旁正常组织(P<0.01)；肺癌组织中Smad2的蛋白表达水平明显高于癌旁正常组织(P<0.01).见表1、图1.

表1 癌旁正常组织和肺癌组织中Smad2的mRNA和蛋白表达水平

图1 Western blot检测癌旁正常组织和肺癌组织中Smad2的蛋白表达

2.2 Smad2基因在人正常肺上皮细胞BEAS-2B与人肺癌细胞A549中表达水平

本研究结果显示：人肺癌细胞A549中Smad2的mRNA表达水平明显高于人正常肺上皮细胞BEAS-2B(P<0.01)；人肺癌细胞A549中Smad2的蛋白表达水平明显高于人正常肺上皮细胞BEAS-2B(P<0.05).见表2、图2.

1、2.对照组、3-甲基胆蒽组第10代Smad2的蛋白表达；3、4.对照组、3-甲基胆蒽组第20代Smad2的蛋白表达；5、6.对照组、3-甲基胆蒽组第30代Smad2的蛋白表达；7、8.对照组、3-甲基胆蒽组第40代Smad2的蛋白表达.

表2 Smad2基因在人正常肺上皮细胞BEAS-2B与人肺癌细胞A549中表达水平

图2 Western blot检测人正常肺上皮细胞BEAS-2B与人肺癌细胞A549中Smad2的蛋白表达

2.3 Smad2基因在3-甲基胆蒽诱导人正常肺上皮细胞BEAS-2B恶性转化过程中mRNA和蛋白表达水平

随着3-甲基胆蒽诱导人正常肺上皮细胞BEAS-2B恶性转化传代数的增加，Smad2的mRNA和蛋白表达水平逐渐降低，其中传代数至第20代、第30代、第40代时3-甲基胆蒽组Smad2的mRNA和蛋白表达水平均明显低于对照组(P<0.05).见表3、图3.

表3 不同传代数的人正常肺上皮细胞BEAS-2B的mRNA和蛋白表达水平

2.4 Smad2基因表达与肺癌患者临床病理特征的关系

Smad2基因表达情况在不同N分期、肿瘤分期的肺癌患者间比较差异显著(P0.05).见表4.

表4 Smad2基因表达与肺癌患者临床病理特征的关系

2.5 Smad2基因表达与肺癌患者术后生存时间和生存率的关系

Smad2基因低表达肺癌患者术后生存时间明显短于 Smad2基因过表达患者(P<0.001).见表5、图4.

表5 Smad2基因表达与肺癌患者术后生存时间和生存率的关系

图4 Smad2基因表达与肺癌患者术后生存情况Kaplan-Meier曲线

2.6 Smad2基因表达对人肺癌细胞A549增殖、迁移和侵袭能力的影响

人肺癌细胞A549增殖能力、迁移细胞数、侵袭细胞数在各组间比较差异显著(P<0.01)；其中，Smad2过表达组细胞增殖能力、迁移细胞数、侵袭细胞数明显低于对照组，Smad2低表达组细胞增殖能力、迁移细胞数、侵袭细胞数明显高于对照组和Smad2过表达组.见表6.

表6 Smad2基因表达对人肺癌细胞A549增殖、迁移和侵袭能力的影响

3 讨 论

人Smad2基因能够编码467个氨基酸，其转录生成的Smad2蛋白是TGF-β调节转录和细胞增殖应答的重要级联因子，也是TGF-β/Smad信号通路中的主要传导分子，受上游和下游多个活性因子的共同调控，其活性改变能够影响细胞结构、细胞周期的改变[9].TGF-β/Smad信号通路功能复杂，对不同条件下肿瘤细胞的增殖、分化具有不同的调节作用，与肿瘤发生与发展密切相关[10].相关研究[11-12]显示，Smad2基因表达可能与胃癌、骨髓增生性疾病、肺动脉高压等疾病明显相关.其中，胃癌组织中Smad2基因表达水平明显下调，骨髓增生性疾病中Smad2的mRNA低表达，肺组织中Smad2基因突变与肺动脉高压的发生与发展密切相关[13].但目前关于Smad2基因在肺癌发生、进展中作用的研究仍十分少见，尤其是对肺癌患者术后生存和标志物筛查的研究还未见报道.

本研究结果显示：肺癌组织中Smad2的mRNA和蛋白表达水平明显高于癌旁正常组织；人肺癌细胞A549中Smad2的mRNA和蛋白表达水平明显高于人正常肺上皮细胞BEAS-2B；且随着3-甲基胆蒽诱导人正常肺上皮细胞BEAS-2B恶性转化过程传代数的增加，Smad2基因表达水平呈逐渐下降趋势，提示Smad2基因可能参与了肺癌的发生发展过程.进一步使用Smad2基因过表达载体和干扰载体转染人肺癌细胞A549，结果显示：Smad2过表达抑制了细胞增殖、迁移、侵袭能力，Smad2低表达促进了细胞增殖、迁移、侵袭能力，提示Smad2基因可能是肺癌的候选抑癌基因.相关研究[14]显示：胃癌患者胃黏液中Smad2基因与慢性胃炎患者胃黏液相比呈明显的高甲基化，使用去甲基化药物处理胃癌细胞后，Smad2基因表达明显上调，提示其在胃癌中可能受甲基化调控.目前，关于Smad2基因可能产生的抑癌表型信号通路和调控的下游基因的研究较为少见.在Smad家族其他基因的相关研究[15]中发现：Smad1、Smad5缺失会诱发小鼠性腺细胞转移瘤，其机制可能与影响BMP/Smad1/Smad5信号通路、抑制内皮细胞迁移相关.结合本研究结果可推测，Smad2基因在肺腺癌病情进展中可能受甲基化调控，通过与BMP、TGF等多种因子相互作用而发挥抑癌活性.

相关研究[16]显示：Smad2的mRNA表达在鉴别正常组织和肿瘤组织方面具有较高的敏感度和特异度，说明Smad2在恶性肿瘤的诊断和预后评估方面可能具有一定的价值.本研究结果显示：N2～N3期、Ⅲ～Ⅳ期的肺癌患者Smad2基因低表达率明显高于N0～N1期、Ⅰ～Ⅱ期的患者.提示Smad2基因表达水平与肺癌肿瘤分期密切相关，这可能对患者术后生存情况评估具有一定的参考价值.Smad2基因低表达肺癌患者术后生存时间、3 a生存率、5 a生存率均明显低于Smad2基因过表达患者，进一步证实了Smad2基因低表达是肺癌不良预后的危险因素，可用于肺癌患者的术后生存预测.

综上所述，Smad2基因是肺癌的一个潜在抑癌基因，其表达与肺癌的发生、发展和术后生存密切相关，可成为肺癌诊治的生物标志物.因此，在今后的研究中有必要进一步探讨Smad2基因在肺癌发生、发展中的分子机制，为肺癌的预防、诊断和治疗提供更多依据.

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