第十三章放射免疫技术

第十三章放射免疫技术 第十三章 放射免疫技术 (Radioimmunoassay technique) 放射免疫技术是把放射性同位素测定的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，在体外定量测定多种具有免疫活性物质的一项技术。根据放射性元素标记抗原还是标记抗体，把它们分成两大类，一类是标记抗原去检测未知抗原，此为经典的测定方法，称为放射免疫测定法(Radioimmunoassay，RIA)。另一类是标记抗体，去检测相应抗体或抗原，这类标记抗体的方法称为免疫放射测定法(Immunoradiometric assy IRMA)。 目前放射免疫技术已发展到研究细胞的受体分子，称为放射受体分析技术Radiorecptor assay，RRA)，是采用放射性同位素标记，配基去检测相应的受体( 分子。这是目前对受体分子进行定量和定位检测最为敏感而可靠的一项技术。另外放射免疫技术在药物的设计、作用机理、生物效应以及疾病的病因探讨诊断和治疗方面均显示出广泛的应用前景。 放射免疫技术是目前血清学和免疫学中最敏感的一种技术。它能检测到毫微克水平，甚至是微微克水平。它具有专一性强，灵敏度和精确度均高等许多优点。 一、标记抗原的放射免疫技术,,IA, (一)原理 当抗原遇到相应的抗体便形成抗原抗体复合物(Ag，Ab ?Ag ,Ab)，当用放射性同位素标记抗原再与相应的抗体结合便形成标记抗原和抗体复合物。即:Ag+Ab?Ag,Ab。当标记抗原和未标记抗原一起加入相应的抗体时则两种抗,, 原产生相互的竞争，而生成有标记抗原和抗体复合物以及非标记抗原和抗体复合物。生成标记抗原抗体复合物与非标记抗原的含量在一定的限度内是呈反比的，所以利用这个原理去测定未知抗原或抗体。 • 1 • ,Ag Ag Ab+Ag(F) , Ab ， ,Ag Ag Ab(B)+Ag Ag,Ab(即结合抗原B)生成量减少，*Ag(即游离抗原F)的如果Ag多则* 剩余量就多。相反，Ag少，则*Ag,Ab生成量就多，*Ag的剩余量就少。通过检测游离抗原F和结合抗原B，就可知未知抗原的存在与否以及含量的多少。 (二)放射免疫抗原的制备 1、完全抗原 为了保证免疫反应的特异性，对放射免疫抗原要求的纯度较高，必须在90%以上。通常采用电泳、凝胶过滤、离子交换层析等技术获得较高纯度的抗原。纯化的抗原必须经过纯度鉴定才能使用。鉴定 办法 鲁班奖评选办法下载鲁班奖评选办法下载鲁班奖评选办法下载企业年金办法下载企业年金办法下载 :通过电泳只出现一条沉 淀线，或者以圆盘电泳进行纯度分析。 2、半抗原 要获得较好的免疫原性，必须将半抗原与蛋白质大分子的载体结 ,合起来形成一个完全抗原。结合的载体，通常包括血清白蛋白、球蛋白、纤维蛋白、甲状腺球蛋白、鸡卵蛋白等。连接方式则因半抗原的功能基团与蛋白质载体功 能基团所决定。常用的连接剂有二亚胺、二异氰酸、过碘酸盐等。 (三)抗体的制备与提纯 见第八章免疫球蛋白的制备与提纯。 (四)抗原的标记 1(放射性同位素的选择 选择同位素的原则。 ? 定方法简单、经济、便于推广应用。 ? 易于防护。 ? 同位素与标记物结合好，不易从标记物上脱落。 ? 对标记物不引起辐射损伤，使蛋白变性。 ? 具有较高的计数效率。 3125 1435323目前常用的同位素有H、I，其它还有C、S和P等。? H 因所有 3的有机化合物中均含有氢，用H来置换氢，不至于影响其原有化合物的化学性质。3,H的半衰期长，是一个弱衰变，能量低，便于防护。一次标记可以使用较长时 3间，采用闪烁仪测量，测量效力可达60%。H标记要求条件较高，一般需由专门 125机构来承担，不易推广;? I 碘标记的化合物比度高，标记方法简便，而且标 125,射线，含有酪氨酸的蛋白记物可在碘化钠晶体,型计数器上直接测定。I发射 质和多肽均可用放射性I标记。目前，连接标记技术已有相当发展，致使许多非蛋 • 2 • 白质和多肽的半抗原也可以用碘来标记。另外碘的放射能量较大，半衰期也较短。 125131125131虽然I的放射比活性仅为I的13%，但I的半衰期较I长，同位素丰 125131度大，辐射损伤小，计数效率也较高，因此I比I更为常用。 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 13-1各种标记同位素的性质比较 同位素 毒性分类 衰变类型 半衰期 ,3, 低毒 12.26年 H ,14, 低毒 5730年 C ,131,,? 高毒 8.07天 I ,EC? 125低毒 60(20天 I ,, 35中毒 67.48天 S ,, 32 14.26天 中毒 P 2(标记方法 目前常用的是碘标记法。碘化标记的方法很多，如氯化碘法、乳过氧化酶法、过氯酸法和连接标记法等。但比较起来，氯胺T法最为简便，效果好，易于采用。 氯胺T碘化标记法的原理:氯胺T是一种氧化剂，在水溶液中可以缓慢地释放次氯酸，因而可以在标记的过程中形成一种能产生温和氧化效果的中间体，它可使放射性碘离子氧化而呈活泼形式的碘离子，并取代抗原分子中酪氨酸苯环羟基邻位的一个或二个氢原子，使之成为含有碘化酪氨酸的多肽链。其记过程为: ? 将蛋白质抗原以0.5Mol/L pH7.5PB液稀释为20μg/μl，取5μl~10μl。 125? 取NaI 5μl(含2mci~3mci)。 ? 将1mg氯胺T溶于0.5Mol/L pH7.5PB液 0.1ml中。 125? 再将NaI和氯胺T分别缓缓加入蛋白质液中，于冰浴中边加边搅拌，加 完后再搅拌5min。 ? 加0.1ml(含3mg)偏重硫酸钠(以PB液配制)。 ? 再加1%碘化钾液1滴，看液体是否完全透明。如仍呈棕色，应继续加少许的偏重硫酸钠。 • 3 • ? 过SephadexG50柱，取第一峰，即为碘标记的蛋白质抗原。 3(标记的最佳条件 ? 放射性碘比活性要高。 ? 反应体积要小。 ? 标记反应的pH值，以pH7.5为宜，超过8.5，碘则取代酪氨酸以外的其它成分。 ? 氯胺T的用量必须事先测定。其方法为定出在标记的蛋白质存在时，10%的三氯醋酸能沉淀最大量放射性碘所需要的最小量的氯胺T。氯胺T的用量必须适当。用量少，虽能满足反应的要求，但产率低;用量大易使蛋白质变性。 ? 蛋白质的浓度决定碘化的效率。对含量中等的氯胺酸的蛋白质而言，在蛋白质浓度为1mg/ml，蛋白质的回收率为100%，浓度为300μg/ml，则为80%,90%，当浓度降至50μg/ml时，则回收率只有60%,70%。 4(标记物的鉴定 ? 放射性化学纯度鉴定是指某一化学形式的放射性物质的放射强度在该样品中所占放射性总强度的百分比。鉴定方法为:取标记的蛋白质或多肽抗原液少许， %,2%载体蛋白及等量的15%三氯醋酸，摇匀静置数分钟后，3 000r/min离加入1 心15min分别测上清液(含游离碘)及沉淀(含标记抗原)的放射活性。一般要求游离碘含量占总放射性碘的5%以下。标记抗原贮藏较久后，仍有部分放射碘从标记物上脱落下来，使用时应除去后再用，否则影响放射免疫分析的精确度。 ? 免疫化学活性鉴定:采用碘标记的抗原，通常由于氧化剂的作用可引起部 314分活性的损伤，而采用H、C等标记的抗原，则不改变抗原的化学结构。免疫活性的检查方法:以小量的标记抗原加过量的抗体，在适当的条件下充分反应后，分离B、F，分别测定其放射性，算出百分结合率。此值应在80%以上，最大可超过90%。该值越大，表示标记的免疫化学活性损失越少。 ? 放射强度:放射性强度以比度表示。即单位重量抗原的放射性强度。比度越高，敏感性越高。因此根据测定需要的敏感度，要求适当比度的标记抗原。标记抗原比度的计算是依据放射性碘的利用率。 • 4 • 标本管CPm一本底CPm， 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 管放射强度标记物的放射强度= 标准管CPm,本底CPm CPm为每分钟的脉冲数。 (五)B、F分离 当标记的抗原与未标记的抗原和抗体结合后，均形成抗原抗体复合物。由于其浓度低，不能自动沉淀。而放射免疫测定的终点决定于标记抗原与竞争者的结合比，因此将抗原抗体复合物与游离的标记抗原分离得完全与否是放射免疫测定的关键。 分离技术的选择是根据抗原的特性、待测生物液体的体积、测定需要的敏感度、精确性以及技术上可达到的熟练程度等。 F分离法见表13-2。 较常用的B、 表13-2 B、F分离法 分离方法 (B) (F) 抗原抗体复合物 游离抗原 平衡透析 在透析袋内 袋内外浓度相等 清蛋白或葡聚糖衣 不被活性炭吸附离心 被活性炭吸附于沉淀中 活性炭吸附 后于溶液中 凝胶过滤 先被洗脱 后被洗脱 微孔滤膜过滤 在醋酸纤维膜上 通过滤膜被洗掉 在球蛋白电泳带 ,电泳和层析电泳 以其自己的电泳泳动度移动 双抗体法 被第二抗体沉淀 离心后在上清液中 结合到固相物上 在溶解相中 固相抗体法 硫酸胺沉淀法 离心后于沉淀中 在溶液中 聚乙二醇(分子量6 000) 离心后于沉淀中 在溶液中 1(盐析法 利用33%饱和硫酸铵液可使其抗原抗体复合物沉淀下来。向溶液内加入饱和硫酸铵，使其最终饱和度达到36%左右，摇匀静置，然后离心沉淀即为 • 5 • 标记抗原抗体复合物，而游离的标记抗原仍留于溶液中。此法的缺点是，游离抗原也同时有随标记抗原抗体复合物沉淀的可能。 2(双抗体法 双抗体法是目前常用的方法，抗体在与标记抗原结合后，同时还具有对抗抗体的结合能力，因此用第一抗体动物的提纯的免疫球蛋白去注射另一种动物，获得第二抗体(即抗抗体)。当第一抗体与标记抗原形成复合物时再遇上第 Ab,Ab(也有Ag,Ab,Ab)更大的复合物而沉淀下来。达二抗体即形成 *Ag,1212 到与游离的抗原分离的目的。此法比较温和，分离也较完全(可达80%,90%)。 3(清蛋白(或葡聚糖衣)活性炭吸附法 是将活性炭悬浮于一定浓度的葡聚糖水溶液中(或清蛋白)，葡聚糖分子在活性炭表面形成一层具有一定孔径网眼的膜，这层膜只允许较小的分子吸附于上面，进而被活性炭所吸附，大分子的物质被排在门外，不被活性炭吸附。从而达到分离的目的。最佳分离条件是pH6.5,9.4?，15min,30min。 此法快速、方便而且分离效果好。但是当标记抗原与抗体结合不牢固时，待游离抗原被活性炭吸附后打破了抗原抗体反应的平衡，而造成抗原抗体复合物的离解。在这种情况下，此法不能应用。 (六)标准曲线的制作 标准曲线的制作直接影响到放射免疫测定的敏感性、精确度和工作范围。 1(抗体滴定曲线的制作 将抗体进行不同的稀释，然后加入等量的标记抗原和非标记已知抗原，分离结合的和游离的标记抗原，测出B/F比率，然后与抗体稀释度(做横轴)作图，绘制曲线。以能结合50%标记抗原的抗体稀释度作为试验中的抗体用量。 100 结 80 合 60 率 40 % 20 1024 4096 16384 65536 抗体稀释度(倒数) 图13-1 • 6 • 2(标准曲线的制作 见图13-1，13-2。 根据抗体滴定曲线，求出能结合50%标记抗原的抗体用量，以此制作标准曲线(又称抗原相加线)。 以此抗体用量，加入不同稀释度的已知抗原和标记的抗原作用一定时间后，分离B、F，测B的放射性，以标记Ag与抗体复合物的脉冲数或结合率为纵坐标，以未标记抗原浓度的对数为横坐标作图。如得不到直线可通过logit计算，将曲线换成直线。在坐标上，曲线的斜率最大的部分是放射免疫测定的工作范围。 10 (Z-1/Z) 1 0.1 100 100010 剂量 10 图13-2 标准曲线的制备 斜率越大，敏感性越高，测定范围小。斜率小，工作范围大，而敏感性就较差。 在同样条件下，测未知样品时，只要测出标记抗原与抗体复合物的放射性，算出结合率，就可以从标准曲线上查出未知抗原的含量。 二、放射免疫测定胰岛素 (一)材料及试剂 1(胰岛素标准品(不同浓度的) 1252( I,胰岛素 3(抗血清 • 7 • 4(第二抗体 5(分析试剂 为0.05 Mol/L pH7.4 PBS液，1,正常兔血清。 6(,计数仪 , 7(试管、加样器、离心机等 (二)操作方法: (按表13,3进行。 1 表13-3 胰岛素RIA测定方法(单位:μu/ml) 标准管 待测管 0 10 20 40 80 160 1 2 试管号 1，2 3，4 5，6 7，8 9，10 11，12 13，14 15，16 标准品(不同浓度) 100 100 100 100 100 100 待测血清 100 100 抗血清(二抗) 100 100 100 100 100 100 100 100 分析试剂 100 100 100 100 100 100 100 100 混匀，37?温育2h 125 I,胰岛素 100 100 100 100 100 100 100 100 混匀，37?温育1h 第二抗体 100 100 100 100 100 100 100 100 混匀，37?反应30min 2(测定和计算 反应完毕后，将各管于室温3 000 r/ min离心30min，仔细吸取上清液，收集于放射性废液贮存容器内。用,计数仪分别测量各管沉淀物(B), 的放射性强度(cpm)，以两管的cpm均值表示。再以第1，2管的cpm值为Bo，分别计算结合率(B%，即B/Bo×100%)，用B%为纵坐标，不同浓度胰岛素标准品为横坐标，绘制标准曲线。然后根据待检管的B%，从标准曲线中即可查得胰岛素的相应含量。 三、标记抗体的免疫放射技术(IRMA) (一)原理 IRMA是采用过量的标记抗体与待测抗原的非竞争性结合反应，然后加入固相的抗原吸附剂以结合游离的标记抗体，离心去沉淀，测定上清液中的 • 8 • 放射性强度，从而推算出待测样品的抗原含量。 (二)放射免疫检测与免疫放射检测(即IRMA与RIA)的区别 见表13,4。 表13,4 IRMA与RIA的区别 IRMA RIA 标记物质 抗体 抗原 标记物用量 过量 限量 反应方式 直接结合 竞争性结合 B、F分离方式 固相抗原免疫吸附剂 第二抗体等 (三)标记抗体的制备 125特异性抗体的制备，质量要求及I标记方法与RIA基本相同。抗体IgG分子中含有多个氨基酸残基，经过碘化反应后，不影响其免疫学活性，并能结合上较多的碘原子，标记物的比放性高，克服了RIA中某些抗原不易标记，或在标记过程中容易发生化学或放射性损伤等缺点。同时纯化的抗体比抗原的纯品来源更为丰富。标记抗体的方法比较单一，也易于掌握，不同于标记抗原，每一种抗原必须标记一次，且抗原复杂，多种多样，标记方法也多种多样。如果将抗体分子酶解成 Fab片段，形成单价抗体，再进行标记，这样其敏感性将显著高于一般的IRMA。 (四)免疫吸附剂的制备 免疫吸附剂是将高纯度的抗原连接在固相载体上而制成。所用固相载体要求对抗原的结合力强，对非特异性蛋白质的吸附性能低，且具有高度的分散性，这样才能大量地结合特异性抗体。一般采用重氮化的纤维素、溴化氰化的纤维素、琼脂糖4B珠、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶和玻璃粉等作为抗原吸附剂的固相载体。 近年来发展建立的双抗体夹心IRMA法，用固相抗体代替抗原免疫吸附剂，反应后形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物，经过洗涤即可除去游离的剩余标记抗体，简化了分离步骤，并保证了较高的特异性。 固相抗体的制备方法有两种:一种是物理吸附法，将塑料小珠浸泡在稀释的抗体中，用前经过洗涤即可。或者将抗体吸附在塑料试管中;另一种是采用化学连接法，将抗体较牢固的结合，这样洗涤时不易脱落，塑料小珠浸泡的条件是50mMol/L pH9.5碳酸盐缓冲液，抗体的浓度为IgG 0.1μg/ml,100μg/ml。塑料试管吸附抗体的条件是抗体浓度0.1μg/ml,100μg/ml 37?、4h,6h或4? 24h。 (四)测定方法 根据试验设计的特点，可分为以下几种类型。 1(直接IRMA法 将待测抗原与过量的标记抗体进行温育，使二者结合。然 • 9 • 后加入固相抗原免疫吸附剂再次温育，吸附游离的标记抗体。离心去除沉淀物，测定上清液中放射性强度。根据标准曲线即可得知待测样品中的抗原含量。 2(双抗体夹心IRMA法 在待测抗原内依次加入固相抗体(或将待测品直接加入抗体包被管内)和标记抗体，反应后形成固相抗体(Ab),抗原,标记抗体(Ab)复l2合物。洗涤除去未结合的游离标记抗体。测定固相抗体或载体上免疫复合物的放射活性，根据标准曲线求得待测得抗原量。此法仅适用于检测有多个抗原决定簇的多肽和蛋白质抗原。 1253(间接IRMA法 此法是在上述双抗体夹心法的基础上，进一步改良为I ,标记Ab的抗体，反应形成的固相抗体(Ab),抗原,Ab,标记抗体(Ab)的四重2123,免疫复合物。其中标记抗体(Ab)可做为通用试剂，由于同种Ab的各种IRMA，32省去了标记针对不同抗原的特异性抗体。 4(BAS,IRMA法 是将生物素,亲和素系统引入免疫放射分析，建立了新 125一代IRMA。此法的最大优点是使用生物素的抗体和以I标记亲和素为示踪剂，可以通用于甾体类、甲状腺素、前列腺素等多种分子物质的检测。固相半抗原结合物经过无水乙醇处理，结合非常牢固，可长期保存;反应和测定在同一试管内完成，操作十分简便，适用于IRMA技术自动化检测。 四、免疫放射测定促甲状腺激素(TSH) (一)材料及试剂 1(标记抗体 2(固相抗原免疫吸附剂 3(标准抗原或待测物标准品 4(待测标本 5(洗液0.05Mol/L pH7.4 PBS液 6(,,计数仪、低温离心机等 (二)操作方法 1( 按表13-5加入各样品，并进行操作。 表13-5 TSH的IRMA测定 • 10 • ※ T 标准管(μIU/ml) 待测 品 0 0.15 0.5 1.5 4 15 60 150 试管号 1，2 3，4 5，6 7，8 9，10 11，13，15，17，19， 12 14 16 18 20 TSH标 200 200 200 200 200 200 200 200 准品 待测样 200 品 125ITSH100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 抗体 37?振荡反应2h 弃上清(T管除外，以下同)加2ml洗液，放置2min 弃上清，再加2ml洗液，放置2min 弃上清，将各官倒置于吸水纸上 ,T为总放射性管 2(测定和计算 用计数仪分别测量各管的放射性强度(cpm)，取各管的平均, 值计算结合率B/T,。以B/T,为纵坐标，TSH标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，根据待测样品管的结合率以标准曲线中即可查知待测样品中的TSH含量。 • 11 •