（Suitableforteachingcoursewareandreports）NK细胞杀伤活性检测兼目的要求熟悉乳酸脱氢酶释放法测定NK细胞杀伤活性的检测方法。【原理】乳酸脱氢酶(LDH)是活细胞胞浆内含酶之一。正常情况下，LDH不能透过细胞膜。当靶细胞受到效应细胞的攻击而损伤时，细胞膜通透性改变，LDH可释放至介质中。释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶Ⅰ(NAD+)变成还原型辅酶Ⅰ(NADH2)。后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原硝基氯化四氮唑蓝(NBT)，形成有色的甲臢类化合物，在490nm或570nm波长处有一高吸收峰。利用读取的A值，经过计算即可得知NK细胞杀伤靶细胞的活性。实验原理效应细胞靶细胞释放LDH丙酮酸乳酸乳酸脱氢酶(LDH)NAD+NADH+H+PMSNBT甲臢(OD570nm）吩嗪二甲酯硫酸盐硝基氯化四氮唑蓝【试剂】1.靶细胞检测人的NK细胞活性常用的靶细胞为体外传代细胞株K562。2.效应细胞从人外周血（肝素抗凝）分离的单个核细胞。3.1640培养液4.LDH底物溶液（临用前配制）NBT硝基氯化四氮唑蓝4mgNAD+I氧化型辅酶I10mgPMS吩嗪二甲酯硫酸盐1mg【试剂】加蒸馏水2ml溶解，混匀后取上清液1.6ml，加1mol/L乳酸钠0.4ml，然后加入0.1mol/LpH7.4PBS至10ml。5.1%NP—40：取1mlNP-40加去离子水99ml。6.1mol/L柠檬酸终止液取柠檬酸21g加去离子水100ml实验步骤效应细胞的制备（分离外周血单个核细胞）靶细胞的制备效-靶细胞相互作用酶促反应结果判读取培养24~48hr的靶细胞(K562),洗涤3次（1000rpm×10min）,最后用完全RPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×105/ml,备用。靶细胞的制备：效应细胞的制备（分离外周血单个核细胞）采集静脉血4ml，加0.2ml肝素溶液（125-250U/ml）抗凝分别吸取2ml淋巴细胞分层液置10ml离心管中，将管倾斜45°，沿管壁缓缓注入抗凝血离心2000rpm×20min密度梯度离心分离淋巴细胞亚群用完全RPMI-1640定容细胞，计数后调整细胞浓度（加入0.2ml完全RPMI-1640，混匀，1x107）将所得PBMC用5倍体积的1640洗涤一次2000rpm×10min用毛细吸管轻轻吸去上层的血浆、稀释液及血小板，再用另一支毛细吸管仔细吸取单个核细胞（灰白色层）计数PBMC1.计数4个大方格中（即64个小方格）所有细胞数2.计数原则：数上不数下，数左不数右。3.总数除以4，所得数据×104即为1ml液体中的细胞总数4.每ml健康成人血可分离出1×106～2×106个单个核细胞计数PBMC举例数4个大方格细胞数分别为：87，79，91，85总数为：87+79+91+85=342一个大方格的平均数为：342/4=85.51ml液体中细胞量为：85.5×104如果用染液稀释后计数，则细胞数为该数据的2倍。效-靶细胞作用将效应细胞和靶细胞各0.1ml(E/T=100:1)加入96孔细胞培养板的孔中,每份标本设2个复孔,同时设靶细胞自然释放对照组(0.1ml靶细胞+0.1mlRPMI-1640液)最大释放对照组(0.1ml靶细胞+0.1ml1％NP-40液),1000r/min,2min后,置37℃、5％CO2温箱中孵育2-4h。A123456789101112实验组自然释放组最大释放组123456效应细胞（100μl）++----靶细胞（100μl）++++++RPMI1640（100μl）--++--1%NP-40（100μl）----++【操作方法】酶促反应：从37℃温箱中取出培养物，吸取各孔上清0.1ml加于另一培养板孔中。酶促反应置37℃预温10min,加入新鲜配制的底物溶液0.1ml,37℃避光反应10～15min。终止酶促反应（用毛细吸管滴一滴1mol/L柠檬酸30μl）A123456789101112结果计算用酶标检测仪在570nm波长下读取各孔OD值,并计算NK细胞活性。实验组OD值-自然释放对照组OD值NK细胞活性（%）最大释放对照组OD值-自然释放对照组OD值=×100%`1、无论采用何种试验方法,靶细胞的质量是影响细胞标记率、自然释放率及实验稳定性的重要因素。一般要求靶细胞的自然释放率<10％。2、分离PBMC时，应用毛细吸管尽可能吸取灰白层，切勿搅动各层。3、吸取细胞培养上清时,应尽可能不吸动沉淀的细胞。4、用此法测得NK活性的正常值范围在10-40%。注意事项:实验报告
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NK细胞杀伤实验的原理、方法、结果。T淋巴细胞检查1．T细胞检查（1）T细胞花环形成试验（Erythrocyterosetteformationtest,ERFT）E花环形成试验（Erythrocyterosetteformationtest,ERFT）【目的要求】1.掌握T淋巴细胞E花环试验的原理、正常值，了解其方法和用途。2.熟悉光镜下E花环的形态和计数方法。【实验原理】T细胞
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面具有能与绵羊红细胞（SRBC）表面糖肽结合的受体，称为E受体（CD2）。已证实E受体是人类T细胞所特有的表面标志。当T细胞与SRBC混合后，SRBC便粘附于T细胞表面，呈现花环状。通过花环形成检查T细胞的方法，称为E花环形成试验。根据花环形成的多少，可测知T细胞的数目，从而间接了解机体细胞免疫功能状态，判断疾病的预后，考核药物疗效等。【实验方法】 淋巴细胞与SRBC按一定比例(1:10)混合37℃5分钟，4℃20分钟取样涂片瑞氏染色、镜检。计数E花环数，算出总花环形成率。正常值为60%~80%。【结果观察】高倍镜检查：淋巴细胞呈蓝色，SRBC呈红色围绕淋巴细胞形成花环，凡表面粘附有3个或3个以上SRBC者为花环形成细胞（即E阳性细胞）。计数200个淋巴细胞，算出花环形成百分率，并推测其T淋巴细胞百分率。正常值为：50～80%。花环形成百分率%= 花环形成细胞花环形成细胞+不形成花环细胞×100%演讲结速，谢谢观赏！Thankyou.PPT常用编辑图使用方法1.取消组合2.填充颜色3.调整大小选择您要用到的图标单击右键选择“取消组合”右键单击您要使用的图标选择“填充”，选择任意颜色拖动控制框调整大小商务图标元素商务图标元素商务图标元素商务图标元素
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