5.生物科技与实践

5.生物科技与实践生物体内物质的分离、鉴定技术淀粉叶绿素还原糖蛋白质 DNA(粗提取后) 碘水蓝色无水乙醇(或95％酒精)、层析液胡黄 a b |划线处菲林试剂 (甲、乙混合) 水浴加热砖红色双缩脲 (先A，后B) 不加热紫色二苯胺水浴加热蓝色 • 叶绿素的提取和分离 • 原理 • 色素能够溶解在有机溶剂无水乙醇中 • 色素不止一种，能溶解在层析液中 • 它们在层析液中的溶解毒不同：溶解度高，随层析液在滤纸上扩散得快；反之则慢 • 二氧化硅有助于研磨充分，碳酸钙可防止研磨色素被破坏 ...

生物体内物质的分离、鉴定技术淀粉叶绿素还原糖蛋白质 DNA(粗提取后) 碘水蓝色无水乙醇(或95％酒精)、层析液胡黄 a b |划线处菲林试剂 (甲、乙混合) 水浴加热砖红色双缩脲 (先A，后B) 不加热紫色二苯胺水浴加热蓝色 • 叶绿素的提取和分离 • 原理 • 色素能够溶解在有机溶剂无水乙醇中 • 色素不止一种，能溶解在层析液中 • 它们在层析液中的溶解毒不同：溶解度高，随层析液在滤纸上扩散得快；反之则慢 • 二氧化硅有助于研磨充分，碳酸钙可防止研磨色素被破坏 • 还原糖鉴定 • 还原性糖包括葡萄糖\果糖\半乳糖，麦芽糖\乳糖等； • 非还原性糖有蔗糖 • DNA粗提取 1. 实验材料选取 2. 破碎细胞，过滤，获取DNA滤液 • 鸡血细胞+蒸馏水 (过滤) • 洋葱细胞+洗涤剂和食盐 (溶解细胞膜，搅拌研磨，过滤) 3. 去除滤液中的杂质 • 方案一：NaCl溶解度 (i)加入2mol/L的NaCl 溶解DNA，过滤，除去不溶的杂质 (ii)调节浓度到0.14mol/L 析出DNA，过滤，除去溶液中的杂质 (iii)再用2mol/L的NaCl溶解DNA • 方案二：嫩肉粉，10～15min，分解蛋白质 • 方案三：恒温箱保温，60～75℃， 10～15min 4. DNA的析出与鉴定 • 加入与滤液体积相等的、冷却的酒精(体积分数95%) • 静置2～3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA 光学显微镜操作技术，染色、装片染色体(有丝分裂) DNA/RNA(分布) 线粒体/叶绿体脂肪质壁分离龙胆紫/醋酸洋红紫色/红色低倍镜 + 高倍镜甲基绿吡罗红 (混合液无先后) 绿色/红色健那绿/－蓝绿色/(绿色) 苏丹III/苏丹IV 橙黄色/红色蔗糖溶液 (紫色) 只用低倍镜第1页共10页生物技术与实践 ! 〇、光学显微镜基础知识 • 光学显微镜看不到核糖体，双层膜结构；能看到线粒体(染色后)、叶绿体 • ➔手写笔记一、取材遵循的原则：有利于装片观察，材料获取便利 • 染色体(有丝分裂) 洋葱根尖细胞 (洋葱根尖分生区细胞，分裂旺盛) • DNA/RNA(分布) 口腔上皮细胞 • 线粒体口腔上皮细胞 • 叶绿体藓类或带叶肉的菠菜叶下表皮 (藓类植物薄而小，叶绿体清楚) • 脂肪花生子叶切片 • 质壁分离紫色的洋葱鳞片叶表皮 (细胞大，液泡呈紫色便于观察) • 在载波片滴加0.9%生理盐水(而不是清水)——保证活体细胞所需的液体环境 • 加盖盖玻片(小正方形薄片)————————为避免挂茶室显微镜接触装片二、制片染色体(有丝分裂) 1. 解离细胞死亡解离液: 酒精＋盐酸 (1:1混合) 用药液使阻止中的细胞互相分离开来 2. 漂洗★ 清水洗去药液，防止解离过度 3. 染色 4. 压片★ 使细胞分散开来，有利于观察双层载玻片(长矩形玻璃)；用拇指压实 DNA/RNA(分布) 1. 水解细胞死亡药剂：盐酸 1.能够改变细胞膜通透性，加速染色剂进入细胞； 2.使染色质的DNA与蛋白质分离，有利于DNA与染色剂结合 2. 冲洗涂片★ 缓水冲去盐酸 3. 染色甲基绿吡罗红混合液(无先后) 线粒体! ! 健那绿活性染料，细胞正常进行生命活动叶绿体! ! 临时黄片中的叶片不能放干了，要随时保持有水状态脂肪 1. 取样用刀片在花生子叶的横断面上平行切下若干薄片 2. 染色从培养皿中选取最薄的切片，加苏丹III/苏丹IV 3. 洗去浮色★ 用吸水纸吸去染液，再滴加酒精溶液洗去浮色质壁分离 • 制作洋葱鳞片叶外表皮的临时装片第2页共10页生物技术与实践三、观察染色体(有丝分裂) • 低倍镜：找到分生区细胞：细胞呈正方形，排列紧密 • 高倍镜：首先找到分裂中期细胞，然后再找前、后、末期细胞，最后分裂间期细胞 • 赤道版是假想位置，看不到。细胞板，看得到。细胞板(壁)的形成与高尔基体有关 DNA/RNA(分布) • 低倍镜：选择染色均匀、色泽浅的区域，移至视野中央 • 高倍镜：观察，调节细准焦螺旋线粒体! • 低倍镜： • 高倍镜：细胞质接近无色，线粒体蓝绿色叶绿体 • 低倍镜：找到叶片细胞 • 高倍镜：仔细观察叶片细胞内叶绿体的形态和分布情况脂肪 • 低倍镜：找到最薄处，移至视野中央 • 高倍镜：视野中被染成橘黄色的脂肪颗粒质壁分离 • 只用低倍镜 1. 低倍镜观察：中央液泡大小，以及原生质的位置 2. 加蔗糖，低倍镜观察 3. 加清水，低倍镜观察四、其他相关内容、原理和现象 • 染色体(有丝分裂) • 有丝分裂位置：常见于根尖、芽尖等分生区细胞 • 原理：染色体容易被碱性染料着色 • 质壁分离 • 原理：由于袁圣志层壁细胞壁的延伸性大，发生质壁分离 • 生活中的现象 • 把白菜剁碎做馅时，常常要放一些盐，稍等一会可见有水分泌出来 • 对农作物是非过多，会造成“烧苗现象” 题目部分分离鉴定实验叶绿素提取（先酒精，后层析液） • ★若要测量微藻细胞中叶绿素含量，需将叶绿素从细胞中提取出来，所用的有机溶剂是[95%酒精]丙酮还原性糖－菲林试剂（甲、乙混合，水浴加热） • 在梨汁中加入菲林试剂，沸水浴后与[未加菲林试剂的梨汁]比较，观察颜色变化，可确定梨汁是否含有还原性糖 • 如何检测高粱叶片种含有还原性糖(写出主要步骤、试剂和判断方法) 第一步：[浸在酒精中隔水加热，使叶片脱绿，用清水漂洗后制成匀浆]；第二步：[向试管内注入2ml待测液，加入1ml新制的斐林试剂，隔水加热]；第三步：[观察颜色变化。如果出现砖红色沉淀，证明含有还原糖]。第3页共10页生物技术与实践 ! 蛋白质－双缩脲（先A、后B，不加热） • 实验原理是：蛋白质与[双缩脲]试剂发生反应，蛋白质含量越高紫色越深 DNA粗提取－二苯胺（水浴加热）利用DNA在不同浓度的氯化钠溶液中[溶解度]不同，得到粗提取的DNA 为证实提取物是否为DNA可用[二苯胺]作为鉴定试剂染色装片实验染色体(有丝分裂) ! 龙胆紫/醋酸洋红 • 取材 • 为了确定某细胞染色体组成，需要做写细胞学实验进行鉴定。 ★取该小麦的[根尖或芽尖]作实验材料分生区细胞 • 观察： • 颜色：观察细胞有丝分裂，观察细胞质壁分离：显微镜下细胞都有紫色但结构不同，造成的原因是[龙胆紫使染色体呈现紫色，液泡细胞液成紫色] • 时期：其中[有丝分裂中期]的细胞染色体最清晰 • 光学显微镜，用于观察染色体 • 从间期进入前期，除了核模、核仁消失外，在显微镜下，还可以观察到[染色体]和[纺锤体]的出现 • 在光学显微镜下可能观察到发生[染色体结构与数目]异常 • 误差：有些因素影响细胞周期各时期的长短，实验过程中也会产生一些误差因而对整个实验结果产生影响。可能的影响因素有①②③⑤⑥ ①取材时间 ②根尖培养温度 ③解离时间长短 ④载玻片厚度 ⑤计数的细胞是否属于分生区细胞 ⑥细胞周期各时期区分是否准确 DNA/RNA(分布)! 甲基绿吡罗红（混合，无先后） • 甲基绿吡罗红染色，镜下观察发现细胞核被染成蓝绿色，细胞质被染成红色，则实验的结论是[DNA主要分布在细胞核中，RNA主要分布在细胞质中] • 二：制片 • 将涂片用盐酸处理后，直接用染色剂染色✕ 1.水解➔2.冲洗➔3.染色 • 染色时，先用甲基绿溶液染色，再滴加吡罗红染色✕ 混合液，无先后 • 三：观察 • 观察时，应选择染色均匀，色泽较浅的区域✓ • 先用地被镜找到较清晰的细胞，然后换上高倍镜✕ “较薄”才对线粒体! ! ! 健那绿（活性染料）；叶绿体脂肪! ! ! 苏丹III/苏丹IV • 苏丹III染液脂肪实验中，需在染色后滴加5酒精，目的是[洗去浮色] 质壁分离 • 细胞失水：质壁分离 • 在适宜浓度蔗糖溶液中，观察细胞[是否发生质壁分离]现象来鉴别细胞壁是否再生 • ★质壁分离，液泡将发生的变化是[液泡缩小(或细胞液浓度增大)]细胞液流失 • 浓度过大：细胞膜破裂 • 转氨酶是肝细胞内参与氨基酸分解与合成的一类酶，正常情况下这类酶不会排出胞外，若在细胞培养液中检测到该类酶，可能的原因是[肝细胞膜受损(或细胞裂解)] • 细胞吸水：质壁分离复原第4页共10页生物技术与实践微生物培养与利用微生物的培养、分离、数量测定 • 接种方法：[平板划线法]、[稀释涂布平板法] • 实验中，应将含有融合子的培养液利用[稀释涂布平板(或平板划线)]方法接种到培养基 • 培养大肠杆菌时，常用的接种方法是平板划线法和[稀释涂布平板法] • 第一步：接种到选择培养基，需要用稀释涂布平板法 • 将深海微生物用[稀释涂布平板]法接种到含酪蛋白的固体培养基表面 • 第二步：“透明圈”、挑取，然后用平板划线法 • 在适宜条件下培养一段时间，挑出形成透明圈的菌落，即为初选出的适冷菌 • ★从平板中挑取实验效果明显的目的菌株，采用[平板划线]法接种于芯的培养基平板，可对菌株进行进一步的纯化 • 纯化、分离方法：[平板划线法]？、[稀释涂布平板法] • 分离及培养：用[稀释涂布平板(涂布分离)]法分离细菌 • 基因工程：欲纯化此工程菌，可以采用[划线（或稀释涂布）]法将菌种接种在[固体]培养基上，以获得[单个]菌落 • 每孔只滴入0.1mL细胞稀释液，其目的是[保证每个孔内不多于一个细胞，达到单克隆培养的目的] (或者[单一细胞培养以保证抗体的纯度]) • 数量测定：[显微镜直接计数法](血细胞计数板)、[稀释涂布平板法](常用)=[间接计数法] • ★若要统计培养液中酵母菌的活菌数目，常用的方法是[稀释涂布平板法] • 测定三种微藻细胞数目时，使用的实验器具包括：试管、滴管、吸水纸、盖玻片、显微镜和[血细胞计数板] • 比较量两种培养基中的[菌落数目]，确定该物质的抗菌效果 • 工具 • 用灭菌、消毒后的[玻璃刮刀(三角刮刀、涂布器)](用具) ，将原液均匀涂布到整个平板 • ★在将配制好的牛肉膏蛋白胨培养基分装到三角瓶中时，为避免培养基沾到瓶口，必须使用[三角漏斗]进行分装 • 培养基 ➔其他－培养基 • 杀菌消毒 • 样品抽取：将经过[灭菌]处理的滤纸贴在桌具表面1min，然后…… • 为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行[高压蒸汽灭菌] • 本实验制备5％葡萄糖溶液，须加热、冷却后再使用，原因是[消灭杂菌和防止温度过高酵母不能生存] • 采样与培养：将采集的土样混合均匀后称取1g，置于经过[高温蒸汽灭菌]法处理的培养基 • 并及时进行[无菌]操作 • 稀释 • ★为避免培养液中菌体浓度过高，需将培养液进行[梯度稀释]处理 • 振荡 • ★振荡培养的目的是：①增加溶液中的[氧气]以满足切段细胞的呼吸需求 ②使切段与溶液成分接触更[充分] • 接种 • ★在培养基中接种[{大肠杆菌}(菌液)] • 倒平板 • 将得到的大肠杆菌B涂布在一个含有氨苄青霉素的培养基上,待平板冷凝后要将平板倒置, 其意义是[防止皿盖冷却水倒流入培养基] • 为避免污染，需要将培养皿呈[倒置]状态放置 • 盖上培养皿盖 • ★“盖上培养皿盖”的目的是[保证{某药物}的浓度] • 基因工程：扩大培养 • 进行扩大培养和获得产品时，应选用[液体]培养基 • 基因工程：产物鉴定 • 继续研究NK的化学组成：因为纳豆激酶存在于[细胞外]，可直接利用纳豆酶发酵的上清液，进一步[分离、提纯]，鉴定其化学组成 • 将重组质粒导入酵母细胞，在培养液中培养一段时间后，收集菌液离心取[上清液](上清液/菌体)进行产物鉴定第5页共10页生物技术与实践 ! 发酵制品实验产品菌种类型过程果酒果醋腐乳泡菜酵母菌醋酸菌毛霉乳酸菌(也可制酸奶) 真核，兼性厌氧原核，好氧真核原核，厌氧 1. 挑葡－冲洗－榨汁 2. 酒精发酵：果酒瓶中预留1/3空气用于有氧增殖先有氧增殖，后无氧生产酒精 3. 醋酸发酵：果醋氧气必须充足 1. 接种毛菌(先) 2. 加盐腌制(后) 3. 加卤汤装瓶 4. 密封腌制 1. 原料－修整同时配置盐水 2. 加入调味料瓷坛 3. 发酵(测亚硝酸盐) 4. 成品(测亚硝酸盐) • 葡萄酒的制作 • 酵母菌作用 • 向消过毒的罐头瓶中加入了新鲜的葡萄汁和酵母菌，添加酵母菌的目的是[酵母菌能分解葡萄糖形成酒精] • 瓶中预留1/3空气用于有氧增殖 • 葡萄汁装入瓶中时要留出大约1/3的空间，这样做的目的是[有利于酵母菌进行有氧呼吸，从而大量繁殖] • 在制作葡萄酒的实验中，将葡萄浆加入发酵瓶的装量不要超过2/3，此操作的依据是[酵母近在有氧时代谢旺盛，增殖快，在无氧时发酵产生酒精] • 泡菜的制作 • 亚硝酸盐含量的测定 1. 配置溶液(亚硝酸钠) 2. 制备标准显色液(不同浓度亚硝酸钠+对氨基苯磺酸溶液) 3. 制备样品处理液 i. 榨汁机粉碎，过滤 ii. 振荡，NaOH，过滤 iii. Al(OH)3，过滤 4. 比色 i. 向样品处理液，滴加对氨基苯磺酸溶液，观察样品颜色的变化 ii. 与标准显色液，比较颜色，找出与标准也最相近的颜色 • 制作泡菜时，常需要检测泡菜中亚硝酸盐含量，以掌握最佳食用时间。具体的检测方法是先制备[亚硝酸标准溶液]，将样品液与其进行[颜色比较]，以此大致估算出泡菜中亚硝酸盐的含量 iii. 记录对应的亚硝酸钠含量，并按照公式计算：含量＝样品中亚硝酸盐含量(mg)/取样量(kg) 第6页共10页生物技术与实践调查调查遗传学调查群体调查家系分析生态学调查样方法标志重捕法遗传学调查 • 遗传病家系图的解题方法➔手写笔记 • [群体调查]＝[群体随机抽样调查] • 某种遗传病的发病率＝(患病人数/被调查人数)×100% • 调查和统计，统计学原理，随即抽样，遗传病发病情况，获取资料和数据 • ★若要了解某病的发病情况，应在人群中[随机抽样]调查并计算发病率取样调查 • [家系分析]＝[家系调查] • 画家系图时，要标I、II、III、……代，同时每代的个体要标1、2、3、…… • ★图21表示对苯丙酮尿症家族的[家系调查]遗传学调查 • 通过对该家族发病率及人群中随机抽样调查可知，[近亲结婚]会导致该病发病率大大提高生态学调查 • 种群密度：种群在单位面积或单位体积中的个体数就是种群密度种群密度是种群最基本的数量特征调查 [种群密度]的方法： • [样方法] • 若调查该农田某种害虫卵的密度应采用的方法是[样方法] • 某种牧草的种群密度，常用的调查方法是[样方法] • [标志重捕法] 第7页共10页生物技术与实践 ! 生物学研究中的科学思想和一般方法做出假设和预期 • 请预测一种实验结果并分析：结果[A比B纤维蛋白块分解快]，分析[说明A比B酶更高效] • 预期结果[黑鲤与红鲤的比例为 3:1] • 如果[实验结果]与[预期结果]相符，说明上述推测成立设计可行的实验方案和实验装置 • 分组 • 首先从[S-Ⅲ型细菌中提取、分离(和鉴定)出各种成分] • 操作 • 然后[分别与R-Ⅱ型细菌混合培养] • 选择纯合黑鲤和纯合红鲤做亲本杂交获得F1； [F1与隐性亲本(红鲤)杂交]； • 观察、统计 • 观察[其后代是否有S-Ⅲ型细菌(菌落)出现] • [观察后代性状表现，统计其性状分离比] • 排除无关变量 • 平行实验 • 每个浓度各做三个培养皿，其目的是[重复实验，减小实验误差] • 为检验该浓度下相关数据的可靠性，还应[重复实验] • 等量处理 • ★将配置好的麦芽汁分装到若干个装置中，每个装置中的麦芽汁应[等量] 不超过瓶体积的 2 3 • ★给予家族[含紫外线和适宜可见光的]光照，给予乙组[同强度可见光的]光照 [含紫外线的]光照，[不含紫外线的]光照 • 对照 • 设置丁烧杯的目的是[对照] • 艾弗里所做的实验中，设置1~5组实验的目的是[相互对照] • 本实验另设1mL无菌水作为空白对照，与1mL蒜汁水的杀菌效果对比，原因是排除[灭菌不彻底对本实验的影响] • 此外，为排除其他因素的影响，提高实验可信度，本步骤徐设计[接种等量无菌水的培养基]作为空白对照 • 其他 • A处处理的目的是[除去样品中原有的矿质元素] • 进行取样记数之前，需将锥形瓶轻轻震荡几次，目的是[使培养液中的酵母菌均匀分布，以减少实验中的记数误差] 收集、分析数据 • 设计表格 • 分组×平行实验，平行实验的平均值 • 收集数据 • 观察纤维素蛋白块分解情况，并记录分解的[时间] • 一段时间后，观察比较并记录每个装置中[彩色液滴向右移动的距离] • ★观察两组幼苗的[长势、高度]<注意>要填一个可测量的量度，而不是模糊的“长势” • [观察后代性状表现，统计其性状分离比] • 分别对A、B瓶进行[定期]取样，通过测定培养液的浑浊度，可估算酵母菌的[种群数量] 第8页共10页生物技术与实践做出合理判断 • R-Ⅱ型菌从S-III中获得了[转化因子]，导致细菌转化，从而恢复了形成荚膜的能力 • 实验结果说明[S-Ⅲ型菌的DNA是使R型细菌发生转化的物质] • 第一组：DNA，实现转化；第二组：DNA＋DNA酶，无法实现转化 ★这两组实验结果说明[DNA结构必须保持完整，才可以有遗传功能] • 在黑暗的条件下，细胞分裂素可延缓成熟绿叶中叶绿素的降解表明细胞分裂素能<延缓叶片衰老>✓<促进叶片衰老>✕ • 假设二中盐酸的作用可能是[模拟胃酸刺激小肠黏膜使其分泌物质] • 实验结果表明，胰液的分泌不只是由神经调节引起的，还可能与[盐酸]有关 • 当人们知道胰岛细胞能分泌胰岛素后，试图从磨碎的狗的胰腺组织中，直接提取胰岛素，但均未成功，原因是[胰岛素会被胰腺细胞中的蛋白酶分解] • 有些叶片经γ射线照射后，喷洒除草剂，仅有个别幼叶的小片组织保持绿色，表明这部分组织具有[抗该除草剂的能力] • 据表分析，酵母菌数量增加，不符合[“J”型增长]。影响该种群数量变化的原因是[由于事物、空间有限及排出的有毒物质和反复取样过程中的污染，都会限制酵母菌种群数量的增加] • 动物受体细胞使用受精卵，原因是[卵细胞较大、全能性较高] • 目的基因导入叶绿体DNA中可以避免“基因污染”，原因是： [叶绿体遗传表现为母系遗传，目的基因不会通过花粉传递在下一代中显现出来] 对简单的实验方案做出恰当的评价和修订第9页共10页生物技术与实践 ! 生物学重大发现的启迪 • 相关题目 • R-Ⅱ型菌从S-III中获得了[转化因子]，导致细菌转化，从而恢复了形成荚膜的能力在格里菲斯所做实验基础上，艾弗里设计了肺炎双球菌的体外转化实验（如下图所示 • 在艾弗里设计的实验中，最关键的思路是，首先从[S-Ⅲ型细菌中提取、分离（和鉴定）出各种成分]，然后[分别与R-Ⅱ型细菌混合培养]，观察[其后代是否有S-Ⅲ型细菌（菌落）出现] 艾弗里所做的实验中，设置1~5组实验的目的是[相互对照]，实验结果说明[S-Ⅲ型菌的DNA是使R型细菌发生转化的物质] 5、6组实验结果说明 ★这两组实验结果说明[DNA结构必须保持完整，才可以有遗传功能] 第10页共10页生物技术与实践

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