实验一培养基配制第一页，共10页实验一培养基的配制及其灭菌实验二外植体灭菌及其初代培养物的建立第二页，共10页实验一培养基配制及其灭菌一、实验目的了解培养基制备方法及灭菌技术。二、实验原理培养基是植物离体培养组织和细胞赖以生存的营养基质，是为离体培养材料提供近似生物体内生存的营养环境。一般常用MS培养基，无机盐浓度较高，能满足组织快速生长的需求。为减少称量的工作量和误差，一般先配制培养基的各种母液，然后按需要量加入。三、实验材料1、实验药品2、实验用具四、实验步骤1、MS培养基母液的配制（1）大量元素母液（母液1）N、P、K、Ca、S、Mg（2）微量元素母液（母液2）Mn、B、Zn、Cu、Mo、Cl、Ni（3）鉄盐母液（母液3）Fe（4）有机物质母液（母液4）NAA、6-BA、GA3第三页，共10页MS培养基配制表母液化合物含量（终浓度）mg/L母液称量（mg）体积（ml）吸取量（ml/L）1号NH4NO3KNO3KH2PO4MgSO4.7H2OCaCl2.2H2O1650190017037044082509500850185022005001002号ZnSO4.7H2OMnSO4.4H2OH3BO3NaMoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCl2.6H2OKI8.622.36.20.250.0250.0250.838602230620252.52.5831000103号Na2－EDTAFeSO4.7H2O37.2527.85372.5278.5100104号盐酸硫胺素VB1盐酸吡哆醇VB6甘氨酸烟酸（VB3）肌醇0.40.520.51004520510001005第四页，共10页2、植物生长调节物质的配制母液含量（终浓度）mg/L母液称量（mg）体积（ml）吸取量（ml/L）NAA2210001006-BA20210010GA310550075配制方法：NAA：称2㎎NAA，加少量95%酒精溶解，再加水定容至1000ml。6-BA：称2㎎的6-BA，加少量1mol/L的NaOH溶解，再加水定容至100ml。GA3：称5㎎，加水定容至500ml。第五页，共10页3、MS固体培养基的配制、分装和灭菌（1）取一只1L烧杯，放入约500mL蒸馏水，依次加入母液1（100mL）、母液2（10mL）、母液3（10mL）和母液4（5mL），并不断搅拌。（本实验2L，先配1L，再配1L）（2）加入植物生长调节物质（NAA:100ml,6-BA:10ml,GA3:75ml）和30g蔗糖，待蔗糖溶解后加蒸馏水定容至1L。（3）加入琼脂（0.6g/L），加热溶解。（5）调整pH6.5。（6）将培养基分装到锥形瓶中，每瓶约300mL.（7）灭菌。放入高压蒸汽灭菌锅中，121℃、0.105Pa灭菌15min。（8）倒平板。所倒培养基约占培养皿的1/3。第六页，共10页五、思考题1、培养基的各种成分在植物体内的生理作用有哪些？2、使用高压灭菌锅在培养基灭菌时应注意哪些问题？第七页，共10页实验二外植体灭菌及其初代培养物的建立一、实验目的通过外植体灭菌及接种等无菌操作训练，掌握植物组织培养材料灭菌的基本方法和无菌操作技术，建立初代无菌培养体系。二、实验原理选取的外植体都不同程度地带有各种微生物，根据实验材料的特点要进行相应的灭菌处理。然后接种到培养基上放入培养室中培养，是之生长，就可以建立起初代培养物的无菌体系。三、实验材料和用具材料：5种草的绿色叶片。第八页，共10页四、实验步骤1、用75%的酒精擦拭干净，将剪刀和镊子浸入75%的酒精中。2、将外植体（绿色草叶）置烧杯中，用水冲洗干净。放入75%的酒精中灭菌30S（不断搅拌），倒掉酒精，用无菌水冲洗3次后，再放入2%的次氯酸钠溶液中灭菌15min。3、将次氯酸钠溶液倒掉，用无菌水冲洗材料3-5次。用镊子取出无菌滤纸，取出叶片放入无菌滤纸上，用镊子和剪刀对叶片进行分割，切成0.5㎝x0.5㎝左右。4、打开培养皿盖子，开口靠近酒精灯2㎝左右，将切碎的叶片接种到培养基中（每个培养基接种10片），盖上盖子。标记植物材料名称、接种日期和接种人。5、接种后的植物材料放入具有控制温度、光照和湿度等条件的培养箱中培养，建立初代无菌培养体系。第九页，共10页五、实验
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及思考1、培养三天后观察实验结果，统计污染率。2、简述无菌操作的一般过程。第十页，共10页
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