第三章 高效液相色谱法 B

第三节高效液相色谱法的主要类型及其分离原理一、液－液色谱法（或称液－液分配色谱法）分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异(一)固定相载体+固定液（物理或机械涂渍法）缺点：系统内部压力大，易流失，不实用常用的几类载体：（1）表面多孔型载体（薄壳型微珠载体）由直径为30～40m的实心玻璃球和厚度约为1～2m的多孔性外层所组成（2）全多孔型载体：由硅胶、硅藻土等材料制成，直径30～50m的多孔型颗粒（3）全多孔型微粒载体：由nm级的硅胶微粒堆积而成，又称堆积硅珠。这种载体粒度为5～10m固定液由于液相色谱中，流动相参与选择作用，流动相极性的微小变化，都会使组分的保留值出现较大的差异。液相色谱中，只需几种不同极性的固定液即可。如β,β′—氧二丙腈（ODPN），聚乙二醇（PEG），十八烷（ODS）和角鲨烷固定液等。(二)流动相要求流动相对固定相的溶解度尽可能小，因此固定液和流动相的性质往往处于两个极端正相色谱——固定液极性>流动相极性极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱适于分离极性组分反相色谱——固定液极性<流动相极性极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适于分离非极性组分二、化学键合相色谱法（一）原理化学键合相：利用化学反应，通过共价键将有机基团键合在载体（硅胶）表面，形成均一、牢固的单分子薄层而构成的固定相分离机制：分配+吸附（以LLC为基础）特点：不易流失；热稳定性好化学性能好；载样量大适于梯度洗脱（二）固定相载体：几乎都用硅胶。一般可分三类：（1）疏水基团如不同链长的烷烃（C8和C18。）和苯基等（2）极性基团如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。（3）离子交换基团如作为阴离子交换基团的胺基，季镀盐；作为阳离子交换基团的磺酸等.键合固定相的制备（l）硅氧碳键型（硅酸酯型）（≡Si-O-C）键合相最先用于液相色谱的健合固定相,用醇与硅醇基发生酯化反应。由于这类键合固定相的有机表面是一些单体，具有良好的传质特性,但这些酯化过的硅胶填料易水解且受热不稳定，因此仅适用于不含水或醇的流动相（2）硅氮型（≡Si-N）键合相将硅胶表面的羟基先转化成卤素（氯化），再与各种有机胺反应，可以得到各种不同极性基因的键合相。可用非极性或强极性的溶剂作为流动相（3）硅碳型（≡Si-C）键合相将硅胶表面氯化后，使Si-Cl键转化为Si-C键。在这类固定相中，有机基团直接键合在硅胶表面上。缺点：该反应不方便；当使用水溶液时，必须限制pH在4～8范围内.（4）硅烷化（≡Si—O－Si－C）键合固定相将硅胶与有机氯硅烷或烷氧基硅烷反应制备。具有相当的耐热性和化学稳定性，是目前应用最为广泛的键合相。固定相在pH=2～8.5范围内对水稳定，有机分子与载体间的结合牢固，固定相不易流失稳定性好。例：十八烷基硅烷键合相（简称ODS或C18）：是最常用的非极性键合相。它们用于反相色谱法，在70℃以下和pH2～8范围内可正常工作（三）流动相1、正相键合相色谱法流动相极性小于固定相极性。常用非极性溶剂如烷烃类溶剂，样品组分的保留值可用加入适当的有机溶剂（调节剂）的办法调节洗脱强度。常用溶剂有：氯仿、二氯甲烷、乙腈、醇类等。适用于分离中等极性化合物，如脂溶性维生素、甾族、芳香醇、芳香胺、脂、有机氯农药2、反相键合相色谱法流动相极性大于固定相极性，多以水或无机盐缓冲液为主体，再加入一种能与水相混溶的有机溶剂（如甲醇、乙睛、四氢呋喃等）为调节。固定相一般为C18、C8应用最广泛正相色谱和反相色谱正相色谱和反相色谱的差别：正相色谱反相色谱固定相极性大小流动相极性小至中等中至大组分流出顺序极性小的组分先流出极性大的组分先流出流动相极性增大保留时间变小保留时间变大分离组分油溶性或水溶性的极性和强极性化合物非极性、极性或离子型化合物三、液－固色谱法（或称吸附色谱法）流动相为液体，固定相为固体吸附剂（一）原理1、分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异分离前提：K不等或k不等2、固定相：与LC比，固定相粒径不同（<10μm）（1）硅胶表面多孔型（薄壳硅胶）全多孔型无定形YWG5~6μm5×104球形YQG3~4μm8×108堆积硅珠YQG3~4μm8×108理想原理：吸附特点：峰易拖尾适用：分离极性化合物（2）高分子多孔小球：YSG原理：吸附+分配兼小孔凝胶作用特点：柱选择性好，峰形好，柱效低适用：分离弱极性化合物3、流动相：底剂（烷烃）+有机极性调节剂例：正己烷或庚烷+氯仿---4、影响k的因素：与固定相性质和流动相性质有关溶质分子极性↑，洗脱能力↓，k↑，tR↑溶剂系统极性↑，洗脱能力↑，k↓，tR↓注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间5、出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱6、硅胶吸水量↑，LSC→LLC硅胶含水量较小吸附色谱硅胶极性较大硅胶含水量>17%分配色谱硅胶失活→载体吸附的水→固定液四、离子交换色谱法（IEC）（一）原理利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离♫适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较广阴离子交换：一般形式：R一A＋B＝R－B＋A阳离子交换：待测离子与离子交换树脂固定相上带电荷基团或游离的离子发生可逆交换反应（二）固定相种类阳离子交换树脂强酸性弱酸性阴离子交换树脂强碱性弱碱性（三）流动相通常是盐类的缓冲溶液改变流动相的pH缓冲剂（平衡离子）的类型离子强度加入有机溶剂、配位剂等常用的缓冲剂有：磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、氨水等五、离子对色谱法离子对色谱法是将一种（或数种）与溶质离子电荷相反的离子（称对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成离子对，从而控制溶质离子保留行为的一种色谱法。离子对形成机理把和被测物离子A电荷相反的离子B（对离子或反离子）加入到流动相中，使待测离子A与反离子B形成中性离子对AB，该AB离子对的性质与A离子或B离子的性质不同，即间接改变了待测离子的保留特性。离子对试剂用于阴离子分离的对离子：烷基铵类，如氢氧化四丁基铵、氢氧化十六烷基三甲基铵等用于阳离子分离的对离子：烷基磺酸类，如己烷磺酸钠固定相和流动相性质同键合相色谱，选择不同的离子对试剂可以分离酸、碱和离子、非离子的混合物六、离子色谱法以离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相，通常以电导检测器为通用检测器。对离子型化合物的分析，离子色谱法是目前唯一能获得快速、灵敏、准确和多组分效果的方法，检测手段已扩展到电导检测器之外的其它类型的检测器，如电化学检测器，紫外光度检测器。可分析的离子从无机和有机阴离子到金属阳离子，从有机阳离子到糖类、氨基酸等均可用离子色谱法进行分析。七、空间排阻色谱法（一）分离原理凝胶内具有一定大小的孔穴小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱中等体积的分子部分渗透体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地被淋洗出来固定相为化学惰性多孔物质——凝胶,类似于分子筛，但孔径比分子筛大。这样，样品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。（二）固定相－－凝胶凝胶是含有大量液体（一般为水）的柔软而富于弹性的物质，是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。软质凝胶分类半硬质凝胶硬质凝胶1、软质凝胶种类：如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶都具有较小的交联结构特点：微孔能吸入大量的溶剂，并能溶涨到它干体的许多倍适用于水溶性溶剂作流动相，一般用于小分子质量物质的分析，不适宜在高效液相色谱中。2、半硬质凝胶（有机凝胶）种类：如苯乙烯二乙烯苯交联共聚物凝胶特点：能耐较高压力，适用于有机溶剂作流动相，有一定可压缩性，可填得紧密，柱效较高。缺点：在有机溶剂中有轻度膨胀。3、硬质凝胶（无机凝胶）是具有一定孔径范围的多孔性凝胶，如多孔硅胶、多孔玻璃珠等凝胶化学惰性、稳定性及机械强度均好，耐高温，使用寿命长，但装柱时易碎，不易装紧，柱效较低。（三）流动相选择依据（从样品的溶解性考虑）流动相应与凝胶本身有相似性黏度低与样品的折光率相差大能润湿凝胶，防止吸附作用常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、N，N’-二甲基甲酸胺、三氯甲烷（凝胶渗透色谱）；水（凝胶过滤色谱）等。第四节液相色谱法流动相一、流动相选择的一般要求1、流动相的纯度2、流动相与固定相不互溶，不发生化学反应3、对试样要有适宜的溶解度4、必须与检测器匹配5、溶剂的粘度要小，可以降低色谱柱的阻力二、常用溶剂的极性常用溶剂的极性顺序为：水（极性最大）、甲酰胺、乙腈、甲醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃、醋酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、氯仿、环己烷、己烷、…三、流动相的选择根据流动相所起的作用，可以把溶剂分为底剂和洗脱剂两种底剂决定基本的色谱分离情况洗脱剂则是为了调节试样组分的滞留并对某几个组分具有选择性的分离作用1、键合相色谱法正相色谱：底剂采用低极性溶剂，如正己烷、苯、氯仿等；洗脱剂则根据试样的性质，有针对性地选择极性较强的溶剂如醚、酯、酮、醇和酸等；反相色谱中：以水为流动相的主体，以加入不同配比的有机溶剂作调节剂。常用的有机溶剂是甲醇、乙腈、二氧六环、四氢呋喃等2、离子交换色谱法离子交换色谱法在含水介质中进行组分的保留值可用流动相中盐的浓度（或离子强度）和pH来控制，增加盐的浓度导致保留值降低。3、排阻色谱法排阻色谱法所用的溶剂必须与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝胶并防止吸附作用。对分离高分子有机化合物，采用的溶剂主要是四氢呋喃、甲苯、间甲苯酚、N,N-二甲基甲酰胺等生物物质的分离主要用水、缓冲盐溶液、乙醇及丙酮等第五节色谱分离条件选择一、减小柱内展宽，提高柱效l、固定相选粒径小的、分布均匀的球形固定相首选化学键合相，匀浆法装柱2、流动相选用低粘度的流动相，有利于增大组分在溶剂中的扩散系数Dm，减少传质阻力例：甲醇、乙腈等3、流速约1ml/min4、柱温的选择：选室温250C左右二、减少柱外展宽1、柱前展宽：主要由进样引起，减小进样器的死体积2、柱后展宽：主要由接管、检测器流通池体积及检测器响应时间等因素所引起三、分离类型的选择1、分析的目的是什么2、分析对象性质及其结构是什么？3、分析样品的复杂程度，大概有多少种组分4、样品量、样品的形态5、要求的检测限、测定限、灵敏度、分析时间6、有无分析实例和 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 样品以及相关分析资料7、实验设备情况液相色谱分离类型选择参考表第六节高效液相色谱法的应用一、在食品分析中的应用1、食品营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类、色素、维生素、香料、有机酸（邻苯二甲酸、柠檬酸、苹果酸等）、有机胺、矿物质等；2、食品添加剂分析：甜味剂、防腐剂、着色剂（合成色素如柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、亮蓝等）、抗氧化剂等；3、食品污染物分析：霉菌毒素（黄曲霉毒素、黄杆菌毒素、大肠杆菌毒素等）、微量元素、多环芳烃等。二、在环境分析中的应用多环芳烃（特别是稠环芳烃）、农药（如氨基甲酸脂类，反相色谱）残留等。三、在生命科学中的应用1、低分子量物质，如氨基酸、有机酸、有机胺、类固醇、卟啉、糖类、维生素等的分离和测定。2、高分子量物质，如多肽、核糖核酸、蛋白质和酶（各种胰岛素、激素、细胞色素、干扰素等）的纯化、分离和测定。例1.环境中有机氯农药残留量分析固定相：薄壳型硅胶(37～50m)流动相：正己烷流速：1.5mL/min色谱柱：50cm2.5mm(内径)检测器：差示折光检测器可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。例2.稠环芳烃的分析稠环芳烃多为致癌物质。固定相：十八烷基硅烷化键合相流动相：20%甲醇-水～100%甲醇线性梯度淋洗，2%/min流速：1mL/min柱温：50ºC柱压：70104Pa检测器：紫外检测器四、在医学检验中的应用1、合成药物：抗生素、抗忧郁药物（冬眠灵、氯丙咪嗪、安定、利眠宁、苯巴比妥等）、黄胺类药等。2、天然药物生物碱（吲哚碱、颠茄碱、鸦片碱、强心甙）等五、在无机分析中的应用阳离子、阴离子的分析等。五、制备型液相色谱（preparativeliquidchromatography）获得高纯物质（色谱纯）的有效方法。半制备柱（内径8mm，长度15～30cm），一次制备量０.1～1mg；1.色谱柱的柱容量（柱负荷）对分析柱：不影响柱效时的最大进样量；对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量；超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%为宜。2.液相制备色谱的方法收集组分时，通常有以下情况：（1）可获得良好分离，主峰使用制备柱，超载提高效率；（2）两主成分之间的小组分；超载，分离切分使待分离组分成为主成分（富集）后，再次分离制备。3.制备型液相色谱制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。制备柱：内径20～50mm，柱长50cm。