miR-205在胆碱能抗炎通路中降低HMGB1表达miR-205在胆碱能抗炎通路中降低HMGB1表达目的：既往研究发现,miRNA在胆碱能抗炎通路中参与早期炎症TNFa和IL-6的调控,而晚期炎症因子是脓毒症持续发生的基础。本研究目的为：(1)胆碱能抗炎通路作为一种转录后调节,与miRNA调节方式相同,那么在胆碱能抗炎通路中是否存在调节晚期炎症因子HMGB1的miRNA,利用miRNA芯片筛选确定差异miRNA。从细胞学水平验证筛选的niRNA能靶向调节HMGB1。(3)通过动物实验,在组织学水平判断目的miRNA在体内能发挥胆碱能抗炎通路的作用,并对各器官中调节...
miR-205在胆碱能抗炎通路中降低HMGB1表达目的：既往研究发现,miRNA在胆碱能抗炎通路中参与早期炎症TNFa和IL-6的调控,而晚期炎症因子是脓毒症持续发生的基础。本研究目的为：(1)胆碱能抗炎通路作为一种转录后调节,与miRNA调节方式相同,那么在胆碱能抗炎通路中是否存在调节晚期炎症因子HMGB1的miRNA,利用miRNA芯片筛选确定差异miRNA。从细胞学水平验证筛选的niRNA能靶向调节HMGB1。(3)通过动物实验,在组织学水平判断目的miRNA在体内能发挥胆碱能抗炎通路的作用,并对各器官中调节作用的差异进行研究。方法：(1)利用miRNA芯片筛选RAW264.7在脓毒症和胆碱能抗炎通路中,晚期炎症因子表达高峰时miRNA表达的差异,利用差异倍数值(Foldchange,Fc)找出在胆碱能抗炎通路中表达升高大于脓毒症组2倍以上的目的miRNA,GeneSpring12.5软件,分别用PITA,TargetScan,microRNAorg三个数据库对符合要求的差异miRNA进行靶基因预测,选出三个数据库筛选出基因的交集,进行后续的基因本体(GeneOntology,GO)和京都基因与基因组百科全书(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes,KEGG)的富集分析研究。(2)Real-timePCR验证目的miRNA芯片表达的准确性。利用miR-205mimics和inhibitor转染RAW264.7,通过对脓毒症组和胆碱能抗炎通路组miR-205、HMGB1和HMGB1mRNA的表达验证miRNA作用的靶基因。检测脓毒症小鼠和胆碱能抗炎通路小鼠血清、脑、心、肺、肾、肝、脾、大肠组织中miRNA、HMGB1和HMGB1mRNA表达的差异,观察miRNA在组织中的抗炎作用。结果：(1)本研究优化了RAW264.7细胞脓毒症LPS浓度和激活胆碱能抗炎通路的GTS-21药物剂量,分别是50ng/ml和8μg/ml。BALB-c小鼠的最佳药物剂量LPS为15mg/kg,GTS-21为4mg/kg。(2)利用差异倍数值,在胆碱能抗炎通路中表达升高大于脓毒症组2倍以上的目的miRNA共38个,其中只在胆碱能抗炎通路中升高的miRNA有4个,分别是miR0205、196a、193b、31。对miRNA进行靶基因预测出2019个靶基因分布于66条通路。选取胆碱能抗炎通路组浓度升高倍数较大的miR-205进行qRT-PCR验证,与芯片的检测结果一致。通过对RAW264.7转染miR-205mimics和inhibitor,转染miR-205mimics的RAW264.7加入LPS后HMGB1表达显著低于脓毒症组；转染miR-205inhibitor组加入LPS+GTS-21抗炎作用消失,HMGB1表达明显升高。两组HMGB1mRNA表达差异没有显著性。(4)在对血清、肺、肝脏、脾脏、大肠、脑、肾、心脏等组织的脓毒症组和胆碱能抗炎通路组miR-205做qRT-PCR检测,观察两组不同组织中miR-205的表达变化。检测的8个器官的组织表达差异均有显著性。胆碱能抗炎通路组的miR-205比sepsis组明显升高。其中GTS-21组中血清、肝、肠、的组织表达超过sepsis组3倍以上。而脑、肾组织的miR-205在CAP组表达升高2倍左右,在心肌组织中升高不足一倍。血清、脑、肾、肠组织,p<0.0001；肝p=0.0011,脾p=0.0054,心p=0.0049肺p=0.0032。用ELISA法对各组织中HMGB1浓度检测,胆碱能抗炎通路组各器官HMGB1较脓毒症组表达下降。血清p=0.0063,脑、肾p<0.0001,心p=0.0561,肠p=0.0068,肺p=0.0010,脾p=0.0090,肝p=0.0006。脓毒症组和胆碱能抗炎通路组HMGB1mRNA表达差异没有显著性(p>0.05)。结论：(1)通过miRNA芯片对激活胆碱能抗炎通路时调控晚期炎症因子的miRNA进行首次全基因谱筛选。发现至少有4个miRNA与晚期炎症因子表达调控有关,分别是miR-205、miR-193b、miR-196a和miR-31。预测出2019种靶基因并进行KEGG分析,共得到66条有意义的通路。(2)通过miR-205mimics和inhibitor转染RAW264.7,证明miR-205在胆碱能抗炎通路中靶基因为HMGB1。通过实验证实miR-205的调控发生在转录后。(4)miR-205在不同组织中,表达量和降低HMGB1的作用均不相同。
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