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半定量PCR半定量PCR一总RNA提取1.将新鲜的悬浮培养细胞(25ml)倒进离心管中,8000g4℃离心10min,弃上清;2.加液氮研磨一次,按108个细胞加1mltrizol,用枪反复吹吸至裂解液无明显沉淀,室温静置10min;3.加200μl氯仿,剧烈震荡20s,室温放置5-10min;4.取上层水相,一般取400μl足够;5.加入等体积异丙醇,摇匀,室温放置10min;6.10000g离心10min;7.75%乙醇1ml洗涤沉淀;8.8000g离心5min;9.弃乙醇,短暂离心,吸干净残余乙醇,室温干燥3-5min;...

半定量PCR
半定量PCR一总RNA提取1.将新鲜的悬浮培养细胞(25ml)倒进离心管中,8000g4℃离心10min,弃上清;2.加液氮研磨一次,按108个细胞加1mltrizol,用枪反复吹吸至裂解液无明显沉淀,室温静置10min;3.加200μl氯仿,剧烈震荡20s,室温放置5-10min;4.取上层水相,一般取400μl足够;5.加入等体积异丙醇,摇匀,室温放置10min;6.10000g离心10min;7.75%乙醇1ml洗涤沉淀;8.8000g离心5min;9.弃乙醇,短暂离心,吸干净残余乙醇,室温干燥3-5min;10.用20μldepc水溶解沉淀;11.电泳:110V,10-15min。(2%琼脂糖胶)2.2.6半定量PCR二基因组DNA的去除RNA样品中痕量的基因组DNA的去除方法参照DNaseI(RNaseFree)试剂说明书进行。对除去基因组DNA的总RNA样品稀释后测定DD260nm和0D280nm,计算RNA的浓度。对初提及去除基因组DNA的总RNA样品各取5μl,2%琼脂糖凝胶,110v电压,l0min电泳后拍照。三第一条链cDNA合成①冰上按以下次序配置体系TotalRNA0.1ng-5μgPrimer(randomhexamerprimer)1μLWater,nuclease-free合计12μL②将体系轻柔混合短暂离心后,在PCR仪进行以下程序:65℃,5min后4℃,5min;③顺次加5×Reactionbuffer4μLRnaseinhibitor(20u/μL)1μL10MmdNTPMix2μLReverseTranscriptase(200u/μL)1μL④将体系轻柔混合短暂离心,在PCR仪进行以下程序:25℃,5min;42℃,60min;70℃,5min。四.内参基因和目的基因引物 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 内参基因需是看家基因,目的基因要求PCR产物在350-800bp之间,且退火温度和内参基因引物的退火温度保持一致。五.内参基因和目的基因退火温度的确定进行不同的变性温度梯度PCR,内参基因和目的基因分管做,PCR结束后进行琼脂糖凝胶电泳六.PCR循环数的确定按普通PCR循环,设定为34个循环,内参基因和目的和目的基因分管作,内参和目的基因都做6管,在PCR的第18、20、22、24、36、28、30、32、34个循环各拿出1管,一起跑电泳。选择循环次数在线性范围内,且电泳效果好的次数作为最佳循环次数。七.半定量PCR采用以上优化好的RT-PCR条件进行PCR
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