2型糖尿病大鼠心脏Toll样受体4表达及辛伐他汀干预的试验研究

2型糖尿病大鼠心脏Toll样受体4表达及辛伐他汀干预的实验研究目的：2型糖尿病（type2diabetesmellitus,T2DM是一种多基因遗传的代谢性疾病，其慢性并发症可广泛累及心、肝、肾、视网膜、血管、神经系统、骨骼肌、皮肤等，其中糖尿病性心脏病严重威胁着糖尿病患者的生命。其发病机理尚未系统阐明，目前认为与氧化应激、炎症反应、糖脂代谢紊乱、胰岛素抵抗、血管壁功能障碍、微循环异常、心肌细胞膜功能改变、糖基化终产物等因素密切相关。近年来，炎症和免疫学说日益引起了人们的关注。Toll样受体4（Toll-likereceptor4,TLR4是介导炎症和免疫反应的主体，可识别多种外源性配体，同时也能识别与炎症、应激、机体损伤等相关的内源性配体，其与配体结合后可激活髓样分化蛋白88依赖性和髓样分化蛋白88非依赖性信号转导途径，从而导致一系列的炎症和免疫反应的发生。TLR4信号转导通路对炎症和免疫反应相关基因的表达有重要的调控作用，因此可将TLR4作为炎症和自身免疫性疾病的治疗靶点。辛伐他汀属于HMG-Co还原酶抑制剂，除了调脂作用外，还可改善内皮细胞功能、抗炎、稳定斑块、抗血栓、抗细胞凋亡等，在免疫、炎症性疾病中具有广大的应用前景。本实验制备T2DM大鼠模型，检测各组大鼠心脏中TLR4的表达情况，以探讨TLR4与T2DML、脏病变的关系及辛伐他汀对糖尿病性心脏病的影响及其机制。方法：40只雄性清洁级Sprague-Dawley（SD大鼠，鼠龄6周，体重为180g±20g。清洁实验室环境下予普通饲料喂养1周，后应用随机数字表法从40只大鼠中随机抽取10只作为正常对照组（A组），其余为实验组。20%对照组继续用普通饲料喂养，实验组用高糖高脂饲料（普通饲料中加入白砂糖、2.5%胆固醇、15%熟猪油）喂养。实验组在高糖高脂饲料喂养4周后，一次性腹腔注射链脲佐菌素30mg/kg。实验第6周末选取空腹血糖（fastingbloodglucose，FBG大于等于7.8mmol/L（正常大鼠空腹血糖3个标准差）且伴有胰岛素敏感指数（insulinsensitivityindex，ISI）降低者作为2型糖尿病大鼠模型，共26只，将其随机分为两组：单纯2型糖尿病组（B组，13只）、辛伐他汀干预组（C组，13只）。辛伐他汀组予20mg/kg辛伐他汀灌胃，每日给药1次，连续灌胃8周，对照组、单纯糖尿病组均予等体积生理盐水灌胃。实验第14周末：1.心脏取血2mL待测FBG甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（totalcholesterol，TC）、低密度脂蛋白胆固醇（lowdensitylipoproteincholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（highdensitylipoproteincholesterol，HDL-C、肌酸激酶（creatinekinase,CK等生化指标。2.取部分心脏置于液氮中保存，采用RT-PCR法检测TLR4mRN的表达水平，且应用ImageJ凝胶图像分析处理系统计算目的片断TLR4/B-actin条带的0D比值；另取部分心脏予4^多聚甲醛固定，待HE染色观察心脏形态学变化，免疫组织化学染色检测TLR4的蛋白表达，且应用Image-ProPlus6.0图像分析软件计算其I0D/Area。应用SPSS13.0统计学软件处理实验数据，所有数据均进行正态性检验、方差齐性检验，服从正态分布资料以均数±标准差表示，偏态分布以中位数、四分位数间距表示。正态分布、方差齐，两组比较采用成组t检验，多组比较采用单因素方差分析，组间比较应用SNK佥验；偏态分布，两组比较采用两独立样本非参数检验，多组比较采用多个独立样本非参数检验，均以PV0.05为差异有统计学意义。结果：1实验第6周末实验数据实验组FBG为11.98±1.97mmol/L明显高于对照组的5.85±1.11mmol/L(Pv0.05);实验组FINS为17.90(3.63)mlU/L,与对照组17.00(5.14)mIU/L比较，差异无统计学意义(P>0.05);实验组ISI为0.0051(0.0018)低于对照组的0.0110(0.0051),差异有统计学意义(Pv0.05)。(Table1，Fig.1-3)2实验第14周末各组大鼠生化指标比较2.1血糖单纯糖尿病组的FBG为12.04±2.04mmol/L,辛伐他汀组的FBG为11.23±2.61mmol/L,均明显高于对照组的5.92±1.28mmol/L，差异均有统计学意义(Pv0.05);而前两组之间的FBG无明显差异(P>0.05)o(Table2,Fig.4)2.2血脂对照组：TG0.80±0.21mmol/L、TC2.47±0.59mmol/L、LDL-C1.21±0.29mmol/L、HDL-C1.87±0.33mmol/L单纯糖尿病组：TG1.86±0.22mmol/L、TC5.15±1.09mmol/L、LDL-C2.13土0.17mmol/L、HDL-C0.67土0.17mmol/L辛伐他汀组：TG1.13±0.27mmol/L、TC3.30±0.91mmol/L、LDL-C1.67±0.33mmol/L、HDL-C1.27±0.30mmol/L结果显示单纯糖尿病组、辛伐他汀组的TGTCLDL-C水平均明显高于对照组，辛伐他汀组的TGTCLDL-C水平低于单纯糖尿病组，差异均有统计学意义(Pv0.05);三组大鼠的HDL-C差异无统计学意义(P>0.05)。(Table2，Fig.5)2.3心肌酶对照组的CK%952(623)U/L,单纯糖尿病组的CK为1307(1430)U/L,辛伐他汀组的CK为1375(741)U/L,三组之间无明显差异(P>0.05)o(Table3,Fig.6)3心脏HE染色对照组大鼠心肌细胞排列规则，细胞结构清晰，胞核似椭圆形或长方形，胞质清晰，偶见炎细胞。单纯糖尿病组大鼠心肌细胞结构不清，细胞明显水肿、变性、坏死，可见广泛性心肌纤维断裂、坏死，间质充血，并可见大量炎细胞浸润。辛伐他汀组大鼠的心肌细胞水肿、变性，心肌纤维断裂，间质充血，炎细胞浸润等情况较单纯T2DM组明显减轻(Fig.7-9)4心脏TLR4蛋白表达水平心脏TLR4蛋白表达主要表现为心肌细胞胞质内的棕黄色颗粒沉着。对照组大鼠心脏有少量表达，呈浅棕黄色；单纯糖尿病组大鼠心脏TLR4的蛋白表达明显高于对照组，呈棕黄色；辛伐他汀组大鼠心脏TLR4的表达较单纯糖尿病组明显减少，但仍多于对照组。免疫组织化学染色图像分析结果示对照组的IOD/Area为0.3210±0.0151；单纯糖尿病组的IOD/Area为0.6157±0.0233，是对照组的1.92倍；辛伐他汀组的IOD/Area为0.4302±0.0224，是单纯糖尿病组的69.87%,差异均具有统计学意义(Pv0.05)。(Table4，Fig.10-12)5心脏TLR4mRN表达水平心脏TLR4mRN的表达结果以rTLR4表示(rTLR4=TLR4ODS/B-actinODfi)。对照组大鼠心脏TLR4mRNA表达较弱，rTLR4为0.42±0.06;单纯糖尿病组大鼠心脏rTLR4为1.43±0.16，是对照组的3.41倍；辛伐他汀组rTLR4为0.73±0.13，是单纯糖尿病组的51.05%,差异均具有统计学意义(Pv0.05)。(Table5，Fig.13)结论:1单纯T2DMBTLR4的蛋白和mRN表达水平明显升高，说明TLR4可能参与了T2DML、脏病变的发生，由此可推断通过干预TLR4信号转导通路中的某些环节则可延缓T2DM、脏病变的发生、发展。2辛伐他汀组TLR4的蛋白和mRN表达水平明显降低，说明辛伐他汀除通过调脂外，还可通过下调心脏TLR4的表达，发挥对T2DML、脏病变的保护作用