干血片苯丙氨酸荧光测定及质控

干血片苯丙氨酸荧光测定法一、苯丙酮尿症筛查的实验方法自从1934年挪威Folling 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 苯丙酮尿症〔PKU〕后，实验 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 方法也越来越多，越来越先进，最早的是1961年美国的Guthrie建立的三氯化铁试验。一、苯丙酮尿症筛查的实验方法目前用于PKU筛查的方法主要有：1.    细菌抑制法2.    荧光分析法3.    酶法4.    高效液相色谱法5.    氨基酸分析法6.    高效毛细管电泳法目前我国苯丙酮尿症筛查的实验方法主要是细菌抑制法和荧光分析法。我们省大都使用荧光分析法。苯丙氨酸荧光测定法一、原理1、原理苯丙氨酸的荧光测定法是McCaman和Robins在1962年建立的测定法，故又称McCaman和Robins法。四十年来不断改正和完善，现已有专门的荧光检测仪及相配套的试剂盒。它比细菌抑制法更灵敏、更快速、操作更方便。绝大多数国家和地区使用此方法，并延续至今。1、原理从干滤纸血片上先提取出的苯丙氨酸，与茚三酮形成一种荧光化合物。苯丙氨酸茚三酮荧光化合物1、原理参加二肽L亮氨酸—L丙氨酸后可大大提高此荧光反响。用琥珀酸盐缓冲液严格控制反响条件pH值在5.8土0.1，可保证理想的荧光值和最大的特异性。荧光化合物L亮氨酸L丙氨酸荧光化合物1、原理参加铜试剂稳定荧光复合物并终止反响，在485nm波长处测定荧光强度。激发光波长390nm。其苯丙氨酸含与荧光强度成正比，即苯丙氨酸含量越高荧光强度那么越强，通过检测浓度的标准血斑的荧光值并绘制曲线那么可求得各样本的苯丙氨酸浓度。2、特点：①荧光物质苯丙氨酸—茚三酮复合物，吸收特定波长〔390nm〕的光能后，发生原子重排，同时发射出波长〔485nm〕更长的光。激发光波长390nm发射光波长485nm荧光化合物2、特点②荧光法测定苯丙氨酸含量结果可靠，批内和批间变异系数(CV)均小于10％。mg/dl(30umol/L)。④血胆红素浓度小于200umol／L时对实验结果无干扰。2、特点⑤通过严格控制pH值可最大程度地降低其他氨基酸的干扰。在土0.1条件下，L甲硫氨酸、L半胱氨酸、L谷氨酸、L组氨酸、L亮氨酸和L—甘氨酸对L苯丙氨酸含量的测定无影响。然而在高pH，例如条件下，其他氨基酸均会产生干扰，荧光强度明显减低。L甲硫氨酸L半胱氨酸L谷氨酸L组氨酸L亮氨酸L—甘氨酸茚三酮无荧光反响土2、特点各种改进后的荧光测定法〔McCaman和Robins法〕已广泛用于血清和干血滤纸标本中的苯丙氨酸定量测定。由芬兰Labsystems公司首先推出基于现代微量反响板的荧光测定法〔McCaman和Robins法〕测定干血斑中苯丙氨酸含量的方法，适用于大规模新生儿疾病筛查。二．仪器和试剂1、仪器荧光读数仪孵育振荡仪自动洗板仪3mm打孔器单道加样器八道加样器电脑显示屏1、仪器①、荧光读数仪；②、孵育／振荡仪；③、3mm打孔器，或打孔钳；④、加样器；八道加样器。以上仪器均由芬兰Labsystems公司提供。⑤、3mm实验血片塑料支架；⑥、电脑、打印机；⑦、冰箱。2、试剂〔1〕琥珀酸缓冲液〔2〕L-亮氨酸L—丙氨酸溶液〔3〕水合茚三酮铜试剂〔4〕标准品〔5〕质控品〔6〕白色酶标板〔7〕酶标板覆盖物芬兰Lab—systems苯丙氨酸荧光测定法试剂盒，包含如下物品：2、试剂①琥珀酸缓冲液〔1〕：土0.1，参加0.05％Bronidoxe(作为防腐剂)；2、试剂②.L-亮氨酸L—丙氨酸溶液〔2〕：参加0.05％Bronidoxe(作为防腐剂)；2、试剂③.水合茚三酮〔3〕：水合茚三酮溶液；2、试剂④.铜试剂〔4〕：无水硫酸铜、酒石酸钠钾和碳酸钠溶液；2、试剂⑤.标准品〔5〕：含5种不同苯丙氨酸浓度(mg/d1)的干滤纸标准血斑。存于装有枯燥剂的铝箔袋中；2、试剂⑥质控品〔6〕：含有2个质控品的l张滤纸，存于装有枯燥剂的铝箔袋中；2、试剂⑦白板〔7〕：白色板(12*8孔)。平底，聚苯乙烯；⑧酶标板覆盖物：在保温和洗脱期间均使用塑料薄膜将板覆盖；2、试剂⑨质控品和标准品的苯丙氨酸浓度数值的卡片及说明 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf ；标准血片浓度mg/dl质控血片浓度mg/dlS10C13S22C27S34S410S520标准品和质控物(品)具有批号特征性。确切值需参照每一试剂盒中校正品的 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 单。校正品由血细胞比容为50％一54％的人血液制备。⑩80%分析纯无水乙醇〔自配〕2、试剂三、实验操作3．实验操作步骤(1)做好实验登记，包括检测日期、检测区间、复查样本号等。编写好实验操作卡；把本次实验要做的标准、质控、复查标本、重查标本及常规标本的卡片号用不同的颜色写在操作卡，看上去一目了然，严防打孔时张冠李戴。第一板123456789101112AAE33399900019000990017900259003390041900499005790065BAE33399CBC166666DBC166666ECC288888FCC288889GD3336689993HD333668999890072试剂批号：85ZE1B-1标准浓度：0.4、2.4、4.7、10.0、20.0。质控批号：85ZE1B-1范围：①高值：4.7-8.7，中值6.7。②低值：1.5-2.8，中值2.1。佛山市新生儿疾病筛查中心实验操作卡检测工程:PKU检测时间:2003年11月11日操3．实验操作步骤(2)对照实验操作卡用打孔器在滤纸上围绕血斑园心与边缘的中点打下直径3mm的标准品和质控物(双孔)、复查和标本(单孔)，并依次放置到洁净的白色板孔内。(3)每孔参加80ul的80％乙醇溶液，用塑料粘胶盖密封酶标板孔，室温振荡(900转／分)30分钟。3．实验操作步骤(4)用多道加液器转移50ul洗涤液至另一块白色酶标板内。如果采用塑料血片支架打孔，那么洗脱30分钟后将血片与支架一起去除即可，无须移液。3．实验操作步骤酶标板数（块）琥珀酸盐缓冲液（试剂1）L-亮氨酸L-丙氨酸二肽（试剂2）茚三酮（试剂3）13.50.71.427.01.42.8依次类推(5)配制反响混合液，如下 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf ：〔单位ml〕3．实验操作步骤(6)加50u1反响混合液，用塑料粘胶盖密封酶标板孔，室温振荡(900转／分)1分钟在+60℃保温60分钟或+37℃保温120分钟一定要密封好！3．实验操作步骤(7)每孔加200ul冷的(直接从冰箱中拿出)铜试剂，用来冷却反响混合物至室温。(8)室温保温15分钟。(9)参加铜试剂后15—30分钟内，检测每孔的荧光值。发射波长485nm，激发波长390nm。PKU实验操作流程检测加铜试剂200μl65℃孵育1h打孔加80%乙醇移液50μl至另一白板内加50μl反应混合液振荡30分钟四、结果判断4．结果判断(1)利用电脑酶标工作软件〔荧光仪配有〕，自动处理绘制标准曲线(标准品)，计算标本的苯丙氨酸的浓度，判断结果。4．结果判断(2)手工计算：①在绘图纸上绘制标准曲线，纵坐标为荧光值，横坐标为标准品苯丙氨酸的浓度；②从标准曲线上读取质控和标本的苯丙氨的浓度。③质量控制值：每套试剂盒内都有一份质控的期望值；4．结果判断④临界值：正常人血苯丙氨酸浓度<2mg／dl。高于或接近临界值的标本需复测。建议每个实验室设定自己的临界值。一定要质控在控才发报告！否那么要查出原因重做实验！5、本卷须知5．操作本卷须知(1)仔细阅读试剂盒使用说明书。(2)标准品和质控物(品)包装一旦开启后，必须密封置2—8℃，枯燥剂应是蓝色的。如变色应放烤箱烤干后再用。(3)建议每一块板都使用标准品和质控物(品)，因为标准品、质控物(品)和未知标本的荧光值可能是变化的。5．操作本卷须知(4)延长洗脱血斑中苯丙氨酸的时间，不影响检测结果，但应考虑80％乙醇蒸发的可能性。(5)推荐操作步骤4选择60℃保温60分钟，可获得更高斜率。在60℃孵育条件下，60分钟后反响到达平衡。而在37℃条件下，反响时间在180分钟内可使荧光强度增加。5．操作本卷须知(6)保温时间和反响温度轻微变化是许可的。然而，较低反响温度和较短反响时间将导致荧光强度下降。(7)当参加铜试剂时，切勿剧烈振荡，以免溅出。谢谢！