YKKstandardizationoffice【YKK5AB-YKK08-YKK2C-YKK18】蛋白质各种定量方法的优缺点的比较蛋白质各种定量方法的优缺点的比较1．蛋白质的常规检测方法凯氏（Kjeldahl）定氮法一种最经典的蛋白质检测方法。原理：样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化,含氮有机物分解产生氨,氨又与硫酸作用变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨,氨用过量的硼酸溶液吸收,再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。优点：范围广泛、测定结果准确、重现性好缺点：操作复杂费时、试剂消耗量大双缩脲法常用于需要快速但并不需要十分精确的蛋白质检测。原理：双缩脲（NH 3CONHCONH3）是3分子的脲经180℃左右加热，放出1分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与硫酸铜形成紫色络合物（肽键中的氮原子和铜离子配价结合），称为双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，因此可用来测定蛋白质含量。测定范围：1~10mg（有的文献记载为1~20mg）优点：较快速，干扰物质少，不同蛋白质产生的颜色深浅相近缺点：①灵敏度差；三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等会干扰该反应。Folin-酚试剂法原理：Folin-酚法的原理与双缩脲法大体相同，利用蛋白质中的肽键与铜结合产生双缩脲反应。同时也由于Folin-酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸试剂被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色的钼蓝和钨蓝的混合物。在一定的条件下,蓝色深度与蛋白的量成正比，由此可测定蛋白质的含量。测定范围：20~250ug优点：灵敏度高，对水溶性蛋白质含量的测定很有效缺点：①费时，要精确控制操作时间；②Folin-酚法试剂的配制比较繁琐,且酚类和柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油、还原剂(二硫代苏糖醇、巯基乙醇)、EDTA和脲素均会干扰反应。紫外吸收法原理：蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基使其在280nm处具有紫外吸收，其吸光度与蛋白质含量成正比)。此外，蛋白质溶液在280nm的吸光度值与肽键含量成正比，利用一定波长下蛋白质溶液的吸光度值与蛋白质浓度的正比关系可以测定蛋白质含量。优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后能回收。缺点：①测定蛋白质含量的准确度较差，专一性差；②干扰物质多，若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。定氮法、双缩脲法、Filon-酚试剂法和紫外吸收法为常用的4种古老的经典方法。考马斯亮蓝法原理：染料考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）及芳香族氨基酸残基相结合，使染料最大吸收峰的位置由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色，在595nm下测定的吸光度值与蛋白质浓度呈正比。优点：灵敏度高，测定快速、简便，干扰物质少，不受酚类、游离氨基酸和缓冲剂、络合剂的影响，适合大量样品的测定。缺点：由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。2.蛋白质的电化学检测方法蛋白芯片技术原理：将各种蛋白质有序地固定于载玻片等各种介质载体上成为检测的芯片，然后用标记特定荧光物质的抗体与芯片上的蛋白质相匹配结合，抗体上的荧光将指示对应的蛋白质及其
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达数量。优点：快速、低成本电化学免疫传感器原理：电化学免疫传感器是基于抗原抗体反应，可进行特异性的定量分析的自给式的集成器件，抗原、抗体是分子识别元件，且与电化学传感元件直接接触，并通过传感元件把某种化学物质浓度信号转变为相应的电信号。3.蛋白质的分子生物学检测方法邻位连接技术原理：首先将不同的DNA单链分别与蛋白质识别分子相结合,形成PLA探针，经过类似酶联免疫吸附法（ELISA）中的温育过程，2条含有不同DNA序列的PLA探针会同时结合到同一个待测蛋白质分子上。此时，2条探针的DNA尾部便在空间上紧密靠近。在过量的互补连接序列和NDA连接酶的作用下，2条探针DNA尾部的游离5’端和3’端与互补序列杂交并发生连接反应，形成一个环状的蛋白质-蛋白识别分子-单链DNA复合物。该复合物量的多少，完全取决于样品中待测蛋白质分子的量，故可用于蛋白质的定量分析。优点：检测灵敏度高、检测特异性强、样品损耗低、操作简单、检测设常见核酸适体原理：直接在核酸适体上共价修饰荧光基团，利用它与靶分子结合时荧光信号的变化实现对靶分子的检测。修饰有荧光熄灭基团的核酸适体探针通过静电作用与阳离子荧光共轭聚合物结合，导致后者荧光熄灭，当加入靶蛋白后，核酸适体探针与其特异性结合，荧光熄灭基团与阳离子荧光共轭聚合物远离，聚合物荧光信号得以恢复。优点：检测限低，检测线性范围广电泳法原理：电泳法,就是指带电荷的供试品（如蛋白质、核苷酸等）在惰性支持介质（如滤纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，在电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，由于各组分之间的移动速度不同，使各组分分离成狭窄的区带，并用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量。优点：操作简便、快速、样品用量少、高自动化。缺点：存在核酸、多糖、脂类等干扰分子，影响检测结果。二甲酸喹啉（BCA）法原理：在碱性溶液中，蛋白质将Cu2 +还原成Cu+，BCA与Cu +结合形成稳定的蓝紫色复合物，在562nm处具有最大吸收峰，在一定条件下，此复合物的吸光度与蛋白质浓度成正比。优点：试剂单一，终产物稳定，除对还原性糖类的干扰敏感外，对其他物质包括常用蛋白质增溶的表面活性物质如SDS等均无影响。缺点：反应时间长且蛋白质也会发生不可逆的变性。4.免疫法免疫扩散法原理：①环状免疫单扩散法，将一定量的抗体（一般常用单价抗血清）与含缓冲液的琼脂糖凝胶混匀铺成适当厚度的凝胶板，再把抗原滴进凝胶板的小孔中，在合适的浓度和湿度环境中，经过一定的时间，抗原由小孔向四周扩散（呈辐射状），与已沉匀在琼脂糖凝胶中的抗体相互作用。当抗原扩散到一定的距离，并见抗原抗体的浓度比例合适时，形成浓沉淀环，这一沉淀是一种抗原抗体复合物。抗体的浓度一定，抗体向琼脂糖凝胶扩散形成的沉淀不再增大，这时沉淀环的大小(面积)与抗原浓度在一定范围内呈线性关系，这样即可定量测定抗原物质-待测样品中蛋白质的含量。②双向扩散法：一定浓度的琼脂糖（或琼脂）凝胶是多孔的网状结构，大分子物质可自由通过，这种分子的扩散作用可使分别在两处的抗原和相应抗体相遇，形成抗原-抗体复合物，比例合适时出现沉淀，沉淀的特征与位置取决于抗原分子量的大小、分子结构、扩散系数和浓度。优点：操作简单缺点：精确度不高
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