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农杆菌感受态制备版本一1.1农杆菌感受态细胞的制备1.1.1.取-7(rc保存的EHA105于含50ug/ml链霉素平板划线,2&C培养。1.1.2.挑取单菌落接种于5mlYM液体培养基中,220rpm28°C振荡培养12-16hro1.1.3.取2ml菌液转接于100mlYM液体培养基中,28°C220rpm振荡培养至0D600二0.5o1.1.4.转入无菌离心管,5000rpm离心5min,去上清液。1.1.5.加入10ml预冷的0.1M的CaC12溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置20mino4°C5000rpm离心5min,去上...

农杆菌感受态制备
版本一1.1农杆菌感受态细胞的制备1.1.1.取-7(rc保存的EHA105于含50ug/ml链霉素平板划线,2&C培养。1.1.2.挑取单菌落接种于5mlYM液体培养基中,220rpm28°C振荡培养12-16hro1.1.3.取2ml菌液转接于100mlYM液体培养基中,28°C220rpm振荡培养至0D600二0.5o1.1.4.转入无菌离心管,5000rpm离心5min,去上清液。1.1.5.加入10ml预冷的0.1M的CaC12溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置20mino4°C5000rpm离心5min,去上清。1.1.6.加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaC12溶液,轻轻悬浮。1.1.7.农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中,每管200u1冻存于-70°Co1.2.双元载体转化农杆菌EHA105取lug左右的质粒DNA加入到200mlEHA105感受态细胞中,混匀后,冰浴30min,-70°C放置lOmino再在37°C水浴5min或42°C水浴lmin,接着冰浴2min,加入800mlYM液体培养基28°C,175rpm摇培3hr后涂在含50Lig/mlKanamycin的YM平板上。281培养到形成单菌落。其中YM可以用LB代替,第一次的CaC12溶液可用溶液(0.lMCaC120.OlTris-HCl(7.0)0.01DTT)替代。时间:2021.01.01创作:欧阳美版本二普通农杆菌感受态制备与转化:1.挑单菌落于2mlYEP培养基(含Rif20mg/ml)中28°C过夜活化。2.取2ml过夜菌液接种于50mlYEP培养基中289生长至0D600约等于0.5左右(4hr)o3.5krpm离心5分钟。4.在10ml0.15MNaCl中悬浮细胞。5.5krpm离心5分钟,悬浮细胞于20ml冰预冷的CaC12o如不是马上使用,可以将之按200ul分装储存于-8(TC待用。6.加lugDNA于200ul感受态细胞中,冰上放置30分钟。7.液氮中冷冻1分钟。8.371水浴溶化细胞。9.加1mlYEP培养基,28£摇床培养2-4hr(低速)。10.离心1分钟,悬浮细胞在lOOulYEP培养基中。11.涂板,281培养2-3天。版本三农杆菌感受态细胞的制备挑取少许农杆菌LBA4404,接种于5mlLB液体培养基(含50mg/LSTR)中,289、200r/mim培养过夜。取2nd培养物于LB液体培养基(含50mg/LSTR)中继续培养,直至0D800为0.5左右。将培养物置冰浴中30min,4°C、5000r/min.离心5min,弃去上清液。用10ml冷的0.lmol/LNaCl悬浮菌液。4°C、5000r/min,离心5min,弃去上清液。6•用lml冷的CaC12(20mmol/L)悬浮,分装成50u1/管,液氮中冷冻后至-80£保存。农杆菌感受态细胞的制备:1.试剂配制:solutionl:Rbcl1.21g100mMMgC12.411201.02g50mMK-Acetate0.29g30mMCaC12.211200.15glOmMGlycerol15%15ml,定容至100mlopH=5.8,121度,高压灭菌30minosolution2:Rbcl0.12glOmMK-Acetate0.lglOmMCaC12.211201.lg75mMGlycerol15%15ml,定容至100mlopH=5.8,121度,高压灭菌30mino农杆菌感受态细胞的培养:15-20ml无抗生素的LB培养基,用牙签挑取农杆菌放入小三角瓶中,28度120转震荡培养过夜。(注意牙签和小三角瓶均需灭菌)制备感受态农杆菌:把已培养过夜的小三角瓶中的农杆菌分装到1.5ml小离心管中,室温下,4,OOOg,离心10mino弃去上清,每管加0.5mlsolutionl,用手指弹管底部,以使菌体悬浮。冰上放置15mim-2ho4度,4,OOOg,离心10mino取出后放在冰上,弃去上清,每管加0.5mlsolution2,用手指弹管底部,以使菌体悬浮,冰上放置15mimo分装感受态农杆菌,每管可分装3-4管。用液氮速冻后至-8(TC冰箱中保存。版本四1)从新鲜YEP(5g/LNaCl,10g/L胰蛋白月东,10g/L酵母浸出物,10g/L琼脂,50mg/L利福平,pH7.0)平板上挑取农杆菌LBA4404的单菌落,接种于5ml液体YEP培养基(含50mg/L利福平)中,28°C200r/min振摇培养过夜。2)取lml菌液接种于50ml液体YEP培养基(含50mg/L利福平)中扩大培养,28°C浴30min,4°C5000r/min离心收集菌体,重悬浮于10ml0.15mol/LNaCl溶液中。4)再次4£5000r/min离心收集200r/min振摇培养至0D600为0.5。3)冰菌体,重悬浮于lml20mmol/LCaC12溶液中,按200µ;1/管分装。制备好的感受态细胞若不立即使用,液氮速冻lmin后,放于-70£冰箱保存,半年内使用。版本五YEB培养基(用于农杆菌培养及感受态制备)蛋白冻(peptone)5g/L蔗糖(sucrose)5g/L牛肉膏(Beefextract)lg/L酵母提取物(Yeastextract)5g/L硫酸镁(MgS04・71120)0.5g/L固体培养基加1.5%琼脂粉,Ph7.2高压灭菌。农杆菌电击感受态制备方法一1、挑取单菌落于YEB振荡过夜2&C培养。2、以1:200接种于400〜500mlYEB培养基中(2000ml三角瓶中),摇菌至0.8〜1.0,冰浴lOmino3、2000g,4°C离心10mi后弃上清,用预冷的10%甘油重悬沉淀。4、3000g,4°C离心lOmin弃上清,用回流甘油重悬沉淀后集中在一管中。5、3000g,4£离心lOmin弃上清,用回流甘油重悬沉淀。6、50口1分装一管,—70°C保存。方法二1、0/Nculturein10mlofYEB/Rif100+Str100毗28°C;2、1:100dilution-growtill0D600二0.5〜0.8,onice30min;3、Pelletat6000rpmfor20mininprecooledcentrifuge,thenresuspendwith1VolofprecooledH20;4、Pelletat6000rpmfor20min,thenresuspendwith0.5Volofprecooled1120;5、Pelletat6000rpmfor20min,thenresuspendwith1/50Volofprecooled10%glycerol;6、Pellet6000rpmfor20min,thenresuspendwith1/500Volofprecooled10%glycerol;7、Aliquot80u1.农杆菌化学感受态制备1、挑取单菌落于YEB振荡过夜28工培养;2、1:50接种于50mlYEB培养基中200rpm28°C培养至0D600二0.5;3、5000rpm4°C离心5min,弃上清后加入10ml预冷的0.15MNaCl悬浮细胞;4、5000rpm4°C离心5min,弃上清后加入51预冷的20mMCaC12悬浮细胞;5、每管200nl分装后一7(TC保存或置冰浴中24小时内使用。时间:2021.01.01创作^欧阳美
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