新版限制性内切酶原理

新版限制性内切酶原理文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！限制酶II型限制酶文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！限制酶定义1限制性核酸内切酶是能够识别DNA特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA一类内切酶,简称限制酶。限制酶在基因工程中广为使用。文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！限制性核酸内切酶分布极广,几乎在全部细菌属、种中都发觉最少一个限制性内切酶。细菌经过本身限制酶,破坏入侵外源DNA,从而保护本身。文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！30多年前,当大家在对噬菌体宿主特异性限制-修饰现象进行研究时,首次发觉了限制性内切酶。细菌能够抵御新病毒入侵,而这种“限制”病毒生存措施则可归功于细胞内部可摧毁外源DNA限制性内切酶。首批被发觉限制性内切酶包含起源于大肠杆菌EcoRI和EcoRII,以及起源于流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）HindII和HindIII。这些酶可在特定位点切开DNA,产生可体外连接基因片段。限制酶的发现文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！命名EcoRIEscherichia属名Coli种名Ry13株系编号文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！切割频率切割频率是指某限制性核酸内切酶在DNA分子中预期切割概率。能够估算该限制性核酸内切酶在某种DNA分子中切点数。前提是:假定DNA碱基组成是均一、碱基排列在DNA分子上是随机分布。这么每个位点上,每一个碱基出现概率即为1/4。假如某限制性核酸内切酶识别序列是6bp,则其切割频率为(1/4)6=1/4096,即每隔4.1kb就可能有一个切割点。当识别序列为n个bp,则其切割频率为（1/4）n。文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！限制酶种类2I型限制酶通常其切割位点与识别位点相距千个碱基,不能正确定位切割位点。比如:EcoB、EcoK。II型限制酶所识别序列多为短回文序列,切割位点与识别位点一致。是基因工程上,实用性较高限制酶种类。比如:EcoRI、HindIII。III型限制酶切割位点与识别位点相距24-26个碱基,不能正确定位切割位点。比如:EcoPI、HinfIII。文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！什么是回文序列？GAATTAAGCTTAATTCGAATATTCCTTATAAG文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！II型限制酶ApaI  识别序列:5'GGGCC^C3'BamHI识别序列: 5'G^GATCC3'BglII  识别序列:5'A^GATCT3'EcoRI  识别序列:5'G^AATTC3'HindIII 识别序列:5'A^AGCTT3'KpnI  识别序列:5'GGTAC^C3'NcoI  识别序列:5'C^CATGG3'NdeI   识别序列:5'CA^TATG3'NheI   识别序列:5'G^CTAGC3'NotI   识别序列:5'GC^GGCCGC3'SacI   识别序列:5'GAGCT^C3'SalI   识别序列:5'G^TCGAC3' SphI   识别序列:5'GCATG^C3'XbaI   识别序列:5'T^CTAGA3'XhoI 识别序列:5'C^TCGAG3' 文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！II型限制酶切割DNA后形成粘性末端或平末端分别由错位切和平切形成。能形成粘性末端酶在基因工程中应用最多。粘性末端和平末端5’NNNGTTAACNNN3‘3’NNNCAATTGNNN5‘5’NNNGTTAACNNN3’3‘NNNCAATTGNNN5’5’NNNGCGGCCGCNNN3‘3’NNNCGCCGGCGNNN5‘5’NNNGCGGCCGCNNN3‘3’NNNCGCCGGCGNNN5‘HaeⅠ识别序列NotⅠ识别序列文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！5’粘性末端和3’粘性末端5’NNGCGGCCGCNN3‘3’NNCGCCGGCGNN5‘5’NNNGC-OHP-GGCCGCNNN3‘3’NNNCGCCGG-PHO-CGNNN5‘5’粘性末端3’粘性末端5’NNGGTACCNN3‘3’NNCCATGGNN5‘5’NNGGTAC-OHP-CNN3‘3’NNC-PHO-CATGGNN5‘文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！同尾酶切割不一样DNA片段但产生相同粘性末端一类限制性内切酶。5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BglⅡ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’XhoⅡ文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！同裂酶有部分起源不一样限制酶识别是一样核苷酸靶子序列,这类酶称为同裂酶。识别序列和切割位点都相同叫同序同切酶,识别序列相同但切割位点不一样叫同序异切酶。比如:HpaⅡ和MspI为同序同裂酶（C^CGG）。XmaI和SmaI为同序异裂酶,都识别CCCGGG,但XmaI切点在C^CCGGG,形成带有CCGG粘性末端;而SmaI切点则在CCC^GGG,形成平末端。文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！有些限制酶识别序列不是回文序列。AccⅠ识别切割位点分别是GTAGAC和GTCTACBbvCⅠ识别切割位点分别为CCTCAGC和GGAGTCG特殊的II型限制酶GT↓ATCGACCATAGC↑TGCC↓TCAGCGGAGT↑CG文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！1) DNA纯度2) DNA甲基化程度3) 酶切消化反应温度4) DNA分子结构5) 限制性核酸内切酶缓冲液6)Star活性（星活性）影响限制性酶活性的因素文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！限制酶消化DNA底物反应效率,很大程度上取决于所使用DNA纯度。DNA制剂中含有蛋白质、酚、氯仿、酒精、EDTA、SDS以及高浓度盐离子等都有可能抑制限制酶活性。提升限制酶对低纯度DNA反应效率,通常采取三种方法:①增加限制酶用量。②扩大酶催化反应体积。（以使潜在抑制原因被对应地稀释）③延长酶催化反应保温时间。DNA纯度文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！DNA甲基化程度识别序列中特定核苷酸甲基化作用,会严重影响酶催化效率。为避免这么问题,在基因克隆中使用质粒DNA是从失去甲基化酶大肠杆菌菌株中提取。文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！酶切消化反应温度不一样限制酶含有不一样最适反应温度。大多数核酸内切限制酶标准反应温度是37℃,有些核酸内切限制酶最适反应温度低于标准37℃,SmaI是25℃、ApaI是30℃;有些高于标准37℃,比如MaeI是45℃、BclI是50℃、MaelII是55℃。文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！DNA分子结构DNA分子不一样构型对限制酶催化效率也有很大影响。一些限制酶切割超螺旋质粒DNA或病毒DNA所需要酶量,要比消化线性DNA高出很多倍,最高可达20倍。文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！核酸内切限制酶缓冲液II型限制酶最适pH通常是6-8,缓冲液中通常含有Mg2+。文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！Star活性（星活性）限制酶在部分特定条件下使用时,识别位点特异性降低,能够把不一样于正常识别序列切断,这个现象叫Star活性。Star活性出现频率,依据酶、底物DNA、反应条件不一样而不一样。Star活性关键受低粒子强度、高pH值以及过高甘油浓度影响。文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！消化DNA样品后,需要钝化内切酶活性,终止反应。方法:1）65℃温浴5-10分钟,使酶失活。2）加入EDTA除去酶分子镁离子,是使酶失活。3）加SDS或者尿素使酶解聚沉淀。4）用等体积酚抽提酶解产物,提取DNA。限制性内切酶反应的终止文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！限制性内切酶的保存限制酶于-20℃用50％甘油保留。文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！基因工程中常见工具酶有限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、逆转录酶、碱性磷酸酶、末端转移酶、甲基化酶。Ⅱ型限制酶在基因工程中应用3文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！将目基因导入受体细胞前,需要用相同限制酶将目基因和载体切成相同粘性末端,再经过碱基互补配对方法,在连接酶作用下,目基因和载体完成连接。最终将连接好重组载体导入细胞。•••NNAAGCTTNN•••NNGGATCCNNN••••••NNTTCGAANN•••NNCCTAGGNNN•••HindIIIBamHINNNNNNNNNNNAAGCTTNN•••NNNGGATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTCGAANN••NNCCTAGGNNNNNNNNNNNNHindIIIBamHI双酶切法文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！NNNNNNNNNNNAAGCTTNN•••NNNGGATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTCGAANN••NNCCTAGGNNNNNNAGCTTNN•••NNGANN•••NNCCTAGNNNNNNNNNNNAAGCTTNN•••NNNGGATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTCGAANN••NNCCTAGGNNNNNNNNNNNN文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！为何通常要用两种限制酶？能够有效预防载体自连造成空载体。文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！连接酶文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！可不能够用一个酶切割目基因和载体？能够,此时切割后载体需要加入碱性磷酸酶处理。碱性磷酸酶能够去除酶切后切口磷酸,从而使粘性末端在加入连接酶后不能重新结合。5’NNNGCGGCCGCNNN3‘3’NNNCGCCGGCGNNN5‘5’NNNGC-OHp-GGCCGCNNN3‘3’NNNCGCCGG-pHO-CGNNN5‘5’NNNGC-OHGGCCGCNNN3‘3’NNNCGCCGGHO-CGNNN5‘碱性磷酸酯酶单酶切法文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！NNNNNNNNNNNAAGCTTNN•••NNNGGATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTCGAANN••NNCCTAGGNNNNNNpAGCTTNN•••NNA-OHHO-ANN•••NNTTCGApNNNNNNNNNNNAAGCTTNN•••NNNAAGCTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTCGAANN••NNTTCGAANNNNNNNNNNNNDNA连接酶文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！基因工程中,很多情况下,基因组中靠近目基因两侧碱基并没有适宜酶切位点。怎么办？Hsp70A:Ex-F5'CGCCA^TATGCCAGCTATCGGAATCGATTTGG3'NdeIHsp70A:Ex-R5'GC^GGCCGCATAAAGGTGGGGAGAGCTTACAAC3'NotI通常是设计适宜PCR引物,让目基因在PCR扩增后,两侧含有酶切位点。文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！DNA甲基化酶4甲基化酶:能够从活性甲基化合物(如S-腺苷甲硫氨酸)上将其甲基转移到其她化合物酶。可形成多种甲基化合物,或是对一些蛋白质或核酸等进行化学修饰形成甲基化产物。DNA甲基化酶:以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体,将甲基转移到DNA特定碱基上过程。文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中一员,用于保护宿主DNA不被对应限制酶所切割。文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！