第二十章 生物制品分析

生物制品分析概论生物制品:以微生物、细胞、动物或人源组织和体液等为原料，应用传统技术或现代生物技术制成。（一）疫苗类（二）抗病毒及抗毒血清类药物（免疫血清类）（三）血液制品（四）重组DNA制品（五）诊断制品第一节生物制品的种类（一）疫苗类用病毒或立克次体接种于动物、鸡胚，或经组织培养后加以处理制造而成。疫苗保留了病原菌刺激动物体免疫系统的特性。当动物体接触到这种不具伤害力的病原菌后，免疫系统便会产生一定的保护物质，如免疫激素、活性生理物质、特殊抗体等；当动物再次接触到这种病原菌时，动物体的免疫系统便会依循其原有的记忆，制造更多的保护物质来阻止病原菌的伤害。1、细菌类疫苗2、病毒类疫苗3、联合疫苗4、双价疫苗及多价疫苗（一）疫苗类1、细菌类疫苗由有关细菌、螺旋体或其衍生物制成的减毒活疫苗、灭活疫苗、重组DNA疫苗、亚单位疫苗。皮内注射用卡介苗、伤寒Vi多糖疫苗、吸附破伤风疫苗、乙型脑炎灭活疫苗、乙型脑炎减毒活疫苗、人用狂犬疫苗等。破伤风杆菌（一）疫苗类2、病毒类疫苗由病毒、衣原体、立克次体或其衍生物制成的减毒活疫苗、灭活疫苗、重组DNA疫苗、亚单位疫苗。口服脊髓灰质炎减毒活疫苗、麻疹减毒活疫苗、风疹减毒活疫苗、腮腺炎减毒活疫苗等。脊髓灰质炎病毒3、联合疫苗两种或两种以上疫苗原液按特定比例配制成的具有多种免疫原性的灭活疫苗或活疫苗。伤寒副伤寒甲乙联合疫苗、吸附百白破联合疫苗、麻疹腮腺炎联合减毒疫苗等。脊髓灰质炎病毒4、双价疫苗及多价疫苗两种或两种以上同一种但不同型（或群）抗原合并组成的疫苗。双价肾综合症出血热灭活疫苗等。脊髓灰质炎病毒（二）抗毒素及抗毒血清（免疫血清类） 抗毒素（抗毒血清）：用细菌类毒素或毒素免疫马或其他大动物所取得的免疫血清破伤风抗毒素、白喉抗毒素和肉毒抗毒素等（二）免疫血清类 抗菌（抗病毒）血清：用细菌、病毒本身免疫马或其他大动物所取得的免疫血清抗蝮蛇毒血清、抗五步蛇毒血清、抗银环蛇毒血清、抗眼镜蛇毒血清、抗炭疽血清、抗狂犬病血清 持续时间短，主要用治疗和紧急预防（三）血液制品由健康人的血浆或经特异免疫的人血浆，经分离、提纯或由重组DNA技术制成的血浆蛋白组分，以及血液细胞有形成分。人血白蛋白、人免疫球蛋白、乙型肝炎人免疫球蛋白等。（四）重组DNA制品（四）重组DNA制品1、细胞因子类：重组人干扰素等2、生长因子类：重组人 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 皮生长因子等3、激素类：重组人生长激素等4、酶类：注射用重组链激酶等5、疫苗：重组乙型肝炎疫苗等6、单克隆抗体：注射用抗人T细胞CD3鼠单抗（五）诊断制品用于检测相应的抗原、抗体或机体免疫状态的制品。毒素、诊断血清、分型血清和因子血清等。分为：1、体外诊断制品2、体内诊断制品（一）需进行相对分子质量的测定大部分为大分子物质（如蛋白质、多肽、核酸、多糖类等），其相对分子质量一般为几千至几十万。对大分子的生物制品而言，即使组分相同，往往由于相对分子质量不同而产生不同的生理活性。所以，生物制品常需进行相对分子质量的测定。一、生物制品分析的特点第二节生物制品分析特点及质量要求（二）需检查生物活性　　在制备多肽或蛋白质类药物时，有时因工艺条件的变化，导致活性多肽或蛋白质失活。因此，对这类生物制品除了用通常采用的理化法检验外，尚需用生物检定法进行检定，以证实其生物活性。（三）需做安全性检查　　由于生物制品的性质特殊，生产工艺复杂，易引入特殊杂质，故生物制品常需做安全性检查，如热原检查、过敏试验、异常毒性试验等。（四）需做效价测定　　生化制品多数可通过含量测定，以表明其主药的含量。但对某些药物需进行效价测定或酶活力测定，以表明其有效成分含量的高低。（五）要用生化法确证结构　　在大分子生物药物中，由于有效结构或相对分子质量不确定，其结构的确证很难沿用元素分析、红外、紫外、核磁、质谱等方法加以证实，往往还要用生化法如氨基酸序列分析等方法加以证实。（一）来源于生物体（二）制造过程涉及生物材料和生物学特征（三）工艺存在易变性和安全性问题二、生物制品生产的特点危险因素：异源物质、不稳定、易受微生物污染全程质量控制：原材料、生产过程、最终产品（1）严格遵守GMP标准（2）建立完善的制造检定规程（3）建立各生产工序相适应的检定方法、标准操作细则（SOP）三、生物制品的全程质量控制《中华人民共和国药典》（2010版三部）项目：1.品名（中文通用名称、英文名称、汉语拼音）2.定义、组成及用途3.基本要求4.制造5.检定（原液、半成品、成品）6.保存运输及有效期7.使用说明（仅预防类含此项）生物制品质量控制的重点：（一）有效成分的同一性、结构确证（二）有效成分的均一性、纯度检验（三）有害物质及残余杂质的控制（四）高效、灵敏的生物活性及比活性实验方法生物制品的质量标准有别于其他商品，强调其特殊性：1、安全性：安全使用，副作用小2、有效性：使用后能产生相应的效力3、可接受性生物制品质量控制的基本内容：（一）鉴别试验（二）杂质检查（三）安全性检查（四）含量（生物学活性或效价）测定（一）免疫学法抗原抗体反应检测新技术：（1）免疫双扩散法凝胶中进行的固相沉淀反应。抗原抗体在琼脂凝胶中扩散，由近及远形成梯度，当两者在比例适当处相遇，发生反应，反应的沉淀物因其颗粒较大，在凝胶中不再扩散，形成沉淀带。第三节鉴别试验（2）免疫电泳法琼脂平板电泳和双相免疫扩散两种方法的结合。将抗原样品在琼脂平板上先进行电泳，使其中的各种成分因电泳迁移率的不同而彼此分开，然后加入抗体做双相免疫扩散，当两者在比例适当处相遇，发生反应，形成沉淀弧。迁移率、分子量（3）免疫印迹法（Westernblot）经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（如硝酸纤维素薄膜）上。以固相载体上的蛋白质作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影，对供试品的抗原特异性进行检查。 （4）免疫斑点法 （5）酶联免疫法:利用酶标记抗原（抗体），通过酶促显色反应，可以直接观察特征颜色变化来测定抗体（抗原）。（二）肽图分析根据蛋白质、多肽的分子量大小以及氨基酸组成特点，使用专一性较强的蛋白水解酶（一般为肽链内切酶）作用于特殊的肽链位点将多肽裂解成小片断，通过一定的分离检测手段形成特征性指纹图谱。 溴化氰裂解-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 胰蛋白裂解-反相高效液相色谱（RP-HPLC） 胰蛋白酶裂解-毛细管区带电泳（CZE）结合N-末端氨基酸序列分析，是蛋白质类生物制品精确的鉴别方法（一）来源于生物体（二）制造过程涉及生物材料和生物学特征（三）工艺存在易变性和安全性问题生物制品生产的特点生物制品危险因素：异源物质、不稳定、易受微生物污染第四节生物制品检查内容一、理化检定（一）物理性状检查（二）蛋白质含量测定（三）防腐剂和灭活剂（四）纯度检查（五）相对分子质量或分子大小测定二、安全检查（一）安全检查对象1.菌毒种和原材料2.半成品3.成品（一）过敏性物质检查（二）杀毒、灭活和脱毒检查（三）毒性物质检查（四）外源性污染检查（二）、安全性检查内容过敏反应检查：检查异性蛋白豚鼠试验法毒性检查：疫苗类生物制品是否存在自身毒素引起的特异性毒性的不安全因素小鼠试验法豚鼠试验法外源性污染检查：是否污染外源性毒性物质以及是否存在意外的不安全因素三、效力测定 1.免疫力试验 2.活菌数和活病毒滴度测定 3.血清学试验3.血清学法体外抗原抗体试验经典血清学反应：（1）凝集反应（2）沉淀反应（3）补体结合反应（4）中和反应经典血清学反应：（1）凝集反应颗粒性抗原（完整的病原微生物或红细胞等）与相应抗体结合，在有电解质存在的条件下，经过一定时间，出现肉眼可见的凝集小块。（2）沉淀反应可溶性抗原与相应的抗体混合，在电解质存在的条件下，两者比例适合，即可有沉淀物出现。沉淀反应抗原多系胶体溶液，沉淀物主要是由抗体蛋白所组成。（3）补体结合反应可溶性抗原与相应抗体结合后，抗原抗体复合物可以结合补体，但这一反应肉眼不能察觉，加入红细胞和溶血素，即可根据是否出现溶血反应来判定反应系统中是否存在相应的抗原或抗体。（4）中和反应抗体与病毒或毒素结合，使病毒或毒素失去致病力或毒性。一、一般杂质检查二、特殊杂质检查三、安全性检查杂质检查抗核抗体Hep-2细胞检查项目：氯化物、硫酸盐、铵盐、铁盐、重金属、酸碱度、溶液的澄清度与颜色、水分及干燥失重、炽灼残渣等。检查方法：同化学药物一、一般杂质检查抗核抗体Hep-2细胞检查意义：（1）特殊杂质可能存在的毒性会引起安全性问题（2）可能影响产品的生物学活性和药理作用（3）反映产品生产工艺的稳定性主要特殊杂质：生物污染物、产品相关杂质、工艺添加剂二、特殊杂质检查抗核抗体Hep-2细胞主要特殊杂质：生物污染物（1）微生物（2）细胞成分（3）培养基成分（4）有关大分子物质二、特殊杂质检查宿主细胞、外源性DNA牛血清白蛋白重组制品中的鼠IgG抗核抗体Hep-2细胞主要特殊杂质：产品相关杂质（1）二聚体和多聚体（2）脱氨或氧化产物（3）突变物（4）错误裂解产物（5）二硫化物异构体二、特殊杂质检查抗核抗体Hep-2细胞主要特殊杂质：工艺添加剂（1）残余抗生素（2）蛋白分离剂（聚乙二醇、乙醇）（3）佐剂氢氧化铝（4）产品稳定剂（辛酸钠、肝素）（5）防腐剂（苯酚、硫柳汞等）（6）细菌与病毒灭活剂（甲醛等）二、特殊杂质检查抗核抗体Hep-2细胞（一）宿主细胞蛋白残留量的检查检查目的：控制异源蛋白的含量，以防超量后引起机体免疫反应检查方法：酶联免疫吸附剂测定法－ELISA二、特殊杂质检查抗核抗体Hep-2细胞（二）外源性DNA残留量的检查检查目的：防止外源性DNA对人类的危害检查方法：分子杂交技术、基于DNA结合蛋白的分析技术、实时定量PCR技术二、特殊杂质检查分子杂交技术：基于碱基互补原理，利用核酸探针与被测定单链基因序列杂交进行检测。（1）菌落原位杂交（2）Southern印迹杂交（Southernblot）（3）Northern印迹杂交（Northernblot）基于DNA结合蛋白分析系统：生物素-DNA单链结合蛋白、尿素酶-抗ssDNA单抗与变性的DNA结合；通过亲和素连接到生物素-硝酸纤维素膜；尿素酶催化尿素分解成NH3和CO2；测定pH。实时定量PCR：（三）产品相关杂质的检查检查对象：同系物、异构体、降解产物等检查方法：高效液相色谱法、电泳法二、特殊杂质检查抗核抗体Hep-2细胞（四）残余抗生素的检查检查目的：控制生物制品制备时抗生素的用量检查方法：抑菌试验二、特殊杂质检查抗核抗体Hep-2细胞破伤风杆菌脊髓灰质炎病毒脊髓灰质炎病毒脊髓灰质炎病毒抗核抗体Hep-2细胞抗核抗体Hep-2细胞抗核抗体Hep-2细胞抗核抗体Hep-2细胞抗核抗体Hep-2细胞抗核抗体Hep-2细胞抗核抗体Hep-2细胞抗核抗体Hep-2细胞抗核抗体Hep-2细胞