检验科微生物实验室作业指导书和相关制度

检验科微生物实验室作业指导书和相关 制度 关于办公室下班关闭电源制度矿山事故隐患举报和奖励制度制度下载人事管理制度doc盘点制度下载 检验科微生物实验室SOP文件 细菌室工作守则 1.每日工作前用紫外线照射实验室半小时以上。 2.入室前应穿工作服，并做好实验前的各项准备工作。 3.实验室内应保持肃静，不准吸烟、吃东西及用手触摸面部。尽量减少室内活动，以免引起风动，无关人员禁入。 4.非必要物品禁止带入实验室，必要资料和书籍带入后，应远离操作台。 5.做好标本的登记、编号及试验记录。未发出报告前，请勿丢弃标本。 6.标本处理及各项试验应在操作间进行，接种环用完后应立即火焰灭菌，沾菌吸管、玻片等用后应浸泡在消毒液内。 7.实验时手部污染，应立即用过氧乙酸消毒或浸于3%来苏儿溶液中5-10分，再用肥皂洗手并冲洗干净;如误入口内，应立即吐出，并用1:1000高锰酸钾溶液或3%双氧水漱口，根据实际情况服用有关药物。 8.实验过程中，如污染了实验台或地面，应用3%来苏儿覆盖其上半小时，然后清洗;如污染工作服，应立即脱下，高压灭菌。 9.若出现着火情况，应沉着处理，切勿慌张，立即关闭电闸，积极灭火。易燃物品(如酒精、二甲苯、乙醚和丙酮等)必须远离火源，妥善保存。 10.工作结束时检查电器、酒精灯等是否关闭，观察记录培养箱、冰箱温度及工作情况，用浸有消毒液的抹布将操作台擦拭干净，并将试剂、用具等放回原处，清理台面，未污染的废弃物扔进污物桶，有菌废弃物应送高压灭菌后处理。 11.离室前工作人员应将双手用消毒液消毒，并用肥皂和清水洗净。 12.爱护仪器设备，经常清洁，注意防尘和防潮。 细菌室消毒隔离措施 1.每天工作前用消毒液消毒工作台，上班前、下班后开紫外灯(最少半小时)进行空气消毒。 2.非必要品禁止带入实验室，必要资料和书籍带入后，应远离操作台。 3.使用后的载玻片、盖片、平皿、试管等用消毒液浸泡，经煮沸后清洗或丢弃。 4.试验后的血液标本用消毒液浸泡后煮沸消毒，所有用于试验的反应板、吸头等用消毒液浸泡(至少24小时以上)后清洗或丢弃。 5.所有微生物培养物(细菌、支原体、真菌等培养物)，不管标本阳性或阴性均用消毒液浸泡后，经煮沸消毒，才能清洗或丢弃。 6.取材、最好采用一次性工具，不能采用一次性工具者，每次取材前均应彻底消毒。 7.用于浸泡各种器械如刮菌刀、持物钳、镊子等的消毒液要定期更换。 8.不慎发生临床标本或培养物污染工作台，不要立即用水冲洗，应先用纸巾、布等敷料加上消毒液(如5%石炭酸、3%来苏儿等)消毒30分钟以上，然后再清洗。如污染工作服，应立即脱下，高压灭菌。 9.实验时手部污染，应立即用肥皂洗手并冲洗干净，再外用消毒药水，如误入口内，应立即吐出，并用1:1000高锰酸钾溶液或3%双氧水漱口，必要时根据实际情况服用有关药物。 检验科 微生物实验室安全与防护 在工作区内禁止饮食，吸烟和存放食物及使用化妆品。 实验室里应保持整洁，不存放与工作无关的杂物。 工作台每天至少用消毒剂清洁一次，在溢渗传染物后要立即消毒、清洗; 进入无菌室必须穿工作服，戴口罩、帽子。 在各种操作进程中均应尽量避免或减少气溶胶产生。 实验工作区禁止无关人员出入，尤其要严禁儿童进入。 工作人员在处理传染性物质或动物之后，以及在离开实验室时要洗手。 凡发生溢漏事故或接触传染性物质后，均应立即报告实验室监督员或实验室主任，并做好书面记录及采取相应措施。结核杆菌的培养及标本涂片务必在生物安全柜里操作。 9. 有涉及感染性材料的操作应在生物安全柜中进行，如结核杆菌培养、感染性组织等。 10. 工作人员在进入实验室工作区前，应在专用的更衣室(或缓冲间)穿着背开式工作服或其它防护服。工作完毕后必须脱下工作服，不得穿工作服离开实验室。可再次使用的工作服必须先消毒后清洗。 11. 工作时必须戴手套(两副为宜)。一次性手套必须先消毒后丢弃。 12. 在实验室中必须配备有效的消毒剂、眼部清洗剂或生理盐水，且易于取用。可配备应急药品。 细菌室内质控制度 每位工作人员必须加强质控意识，以质量控制工作为核心，认真做好各项质控试验和记录。 加强质量控制和专业理论知识的学习，规范操作，正确分析处理结果。 一旦发现失控，及时采取相应措施，纠正失控结果。 每批自配或购置的培养基、生化鉴定等试剂必须用标准菌株ATCC27853、ATCC25923、ATCC25922质控。合格方可使用，并作好记录。 每周进行药敏试验质量控制。对每批微量药敏板、培养基、药敏纸片必须用ATCC27853、ATCC25923、ATCC25922菌株进行质控，并做好记录，出现问题及时分析，采用相应措施。 每天观察培养箱、CO2培养箱、冰箱的温度，并做好记录。 无菌间每周监测一次，三氧机、紫外线消毒灭菌情况，并做好记录。 每三个月用ATCC27853、ATCC25923、ATCC25922菌株对全自动微生物分析仪进行鉴定和药敏质量控制。 认真讨论、分析每次参加卫生部室间质评结果。总结经验教训。 临床微生物及实验室的医院感染管理 检验科医院感染管理应达到以下要求: 工作人员必须穿工作服,戴工作帽,必要时穿隔离衣，胶鞋，戴口罩,手套。 使用合格的一次性检验用品,用后进行无害化处理。 严格执行无菌技术操作规程,静脉采血必须一人一针一管一巾一带;微量采血应做到一人一针一管一片;对每位病人操作前洗手或手消毒。 无菌物品如棉签,棉球,纱布等及其容器应在有效期内使用,开启后使用时间不得超过24小时.使用后的废弃物品,应及时进行无害化处理,不得随意丢弃。 各种器具应及时消毒,清洗;各种废弃标本应分类处理(焚烧,入污水池,消毒或灭菌)。 报告单应消毒后发放。 检验人员结束操作后应及时洗手,毛巾专用,每天消毒。 保持室内清洁卫生.每天对空气,各种物表及地面进行常规消毒.在进行各种检验时,应避免污染;在进行特殊传染病检验后,应及时进行消毒,遇有场地,工作服或体表污染时应及时处理,防止扩散,并视污染情况向上级报告。 菌种、毒种按《传染病防治法》进行管理。 实验室的医院感染管理参照检验科的管理要求.实验动物应严格管理,防止逃逸或造成人与实验室动物的交叉感染;实验后的动物必须焚化进行无害化处理。 细菌鉴定和药敏试验操作按全国临床检验操作规程。 负责鉴定及签发报告的主管技术人员应通晓诊断细菌学的全面知识。 从事细菌专业技术人员，应了解医院监测知识，掌握其检测方法，定期统计分析医院感染细菌分布，耐药变迁，并将其结果反馈临床。 细菌室工作人员均应具备细菌传染、消毒、灭菌知识。 细菌专业人员不断更新知识，了解细菌学检验新进展。 定期或随时与临床联系，主动参与病例讨论了解病情及治疗情况，达到细菌检验与临床的密切联系。 每天发出的微生物报告应认真复审，分析报告、评价报告。 工作人员加强有菌观念，无菌操作。 当工作环境被细菌污染，必须立即消毒处理，报告主管人员，采取必要措施。 10工作人员被细菌培养物污染应消毒处理，必要时给予药物治疗，并向主管负责人报告，采取特殊措施。 无菌间规章制度 每一个工作人员必须树立无菌观念，严格进行无菌操作。 在无菌室内必须戴帽子、口罩，进行无菌操作。 每天早上8:00—8:30用紫外线消毒或在凌晨4-6点用多功能机消毒2小时，每月检查一次紫外灯的无菌效果。 无菌室内各种废弃物品必须煮沸消毒。 实验完毕后，用含氯制剂1000mg/L消毒桌面、地面。 菌(毒种)管理办法 1. 菌种保管应有专人负责，保存于冰箱中，房门专人加锁，确保菌种安全。保管人员变动 时，必须严格交接手续。 2、菌种应有严格的登记，包括形态，分离日期，鉴定日期，签发者，主要鉴定性能(包 括形态、染色、抗原结构、动物致病力等)，并注明使用、转移、销毁情况及原因。 3、各种菌种应按规定时间接种，一般在接种三次后作一次全面的鉴定，注意菌种有无 污染及变异，如发现变异时，应及时更换。 4、菌种保存范围及向外单位转移，应按国家卫生部规定执行。 5、所有存在菌种应具备清单。 细菌室仪器维护保养及质控措施 我室主要仪器为BacT/Alert 120、BACTEC9050血培养仪和Vitek-32、BD凤凰全自动细菌鉴定和药敏分析仪，为了使仪器能够高质量的运行，使仪器报告的结果准确可靠，特制定以下仪器维护、保养和质控措施。 一、BacT/Alert 120 、BACTEC9050血培养仪的维护、保养和质控措施 1.每天上班开始工作前和下班离开前要检查仪器的工作状态是否正常，仪器培养箱温度的报告里外是否一致。 2.每天用中性的清洁液将仪器表面擦拭干净 3.每天先做质控。 4.一个月至少做一次全程定标。 5.仪器检测数据每周星期六做备份。 6.仪器每一个月做一次彻底的清洁保养，包括清洁外壳、瓶孔、滤网等 7.仪器每年请工程师做一次检定工作。 二、Vitek-32、BD凤凰全自动细菌鉴定和药敏分析仪的维护、保养和质控措施 1.每天上班开始工作前和下班离开前要检查仪器的工作状态是否正常。 2.每天用中性的清洁液将仪器表面擦拭干净 3.购买的新批号的试剂都必须先做质控，质控合格后才能用于临床检测。 4.仪器检测数据每周星期六做备份。 5.仪器每一个月做一次彻底的清洁保养，包括清洁外壳、卡片架、滤网等 6.仪器每年请工程师做一次检定工作。 标准菌株保存及使用 概述:标准菌株是细菌室室内质控工作必不可少的、重要的生物资源，我室的标准菌株主要来自省临检中心的发放和从卫生部临检中心以及国家菌种保存中心购买所得，为了让标准菌株能够得到合理的应用，特制定以下规定。 1.对每批购买的标准菌株要做好登记，包括菌种的菌名、编号、购买时间、保存地点、记录人等 2.每次使用标准品都应作好使用记录，包括标准品的名称、编号、使用时间等。 3.购买的标准品初次使用时，应大量增殖，然后分装在含10-15%甘油的胰蛋白胨肉汤中，-20?以下保存。 4.新的标准菌株复苏最多不得超过三次，如超过三次将不在视为标准菌株使用。 5.标准菌株保存管一经溶化使用后，不得再次冻存。 细菌室内务管理规定 1.细菌室岗位分工与职责管理规定 1.1 概述 鉴于细菌室工作琐碎烦杂且千头万绪，为了使细菌室的工作能够保质保量地顺利完成，特将细菌室暂定为两个岗位，以明确工作范围、增强责任心、便于日常工作的完成。当然由于细菌室不同岗位工作量的随机性较大，故我室要求大家发扬既分工，又协作的精神，共同完成细菌室工作。 1.2 岗位职责 各岗位工作人员要求严格按照作业指导书进行操作，高质量的完成本岗位工作，如遇到问题须提出经讨论解决。 1.3 岗位分工 岗位?:完成细菌培养标本(?号菌培养除外)的结果观察处理及报告发放。 岗位?:完成仪器的维护、保养和质控工作等。 2.细菌室记录内容明细 2.1 环境条件 室内温度、湿度，每天一次，上午记录。 2.2 恒温设备2.3 孵箱、普通冰箱，每天一次，上午记录。 2.3分析仪器 常规每日保养一次，发现问题随时详细记录;质控按要求测试完毕后，及时手工记录， 2.4标本与结果 不合格标本记录、危急值报告记录、结果记录。 2.5岗位记录(附表:细菌室岗位记录表) 2.6其它记录，如交班记录等。 3.细菌室室内环境条件控制范围 温度18,28?，湿度20,80,。 检验科 作业指导书 细菌室内务管理规定 文件编号:LAB,SOP,JX011 第2页，共2页 版本:1 生效日期:2005-11-01 标本采集及保存要求 1总则:用于细菌培养的标本在收集时应注意严格无菌操作和及时送检，检测后标本应妥善保存。 2.临床标本的采集 2.1下呼吸道分泌物(痰液) 令患者早上起床后用清水濑口，不要刷牙，立即从下部呼吸道咳出第一口痰，吐在无菌塑料痰盒中，及时送检。 2.2尿液(中段尿) 护理人员协助采取中段尿约3ml入无菌试管中，及时送检。 2.3粪便:取有粘液、脓血部分的粪便置玻璃大便专用管中，如为稀水便，可直接收集于玻璃管中，及时送检。 2.4眼、耳、鼻、喉拭子:将棉拭子沾取少许无菌生理盐水(如沾取的太多，可在无菌生理盐水瓶壁上挤去多余的水份)，然后采取可疑部位的分泌物，倒悬于无菌试管内,及时送检。 2.5脓液:用沾有生理盐水的棉拭子沾取脓液，要尽量多取一些，然后将棉拭置于无菌试管中，及时送检。 2.6血液: 2.6.1凡怀疑菌血症和败血病的患者，采血培养时，应尽量在未使用抗菌素前采血，如已使用抗菌素， 应尽量选择抗菌素在体内浓度最低时采血，应在病人第二次使用抗菌素之前采集血培养标本。当然在 病人发热或寒颤时采集也可。 2.6.2成人每次采血5—10ml，小儿采血2—3ml; 2.6.3严格消毒病人采血部位和血培养瓶口，抽一定量血液后，无菌注入血培养瓶内，轻轻摇匀， 2.6.4从抽血到接种入瓶，动作要快，防止血液凝固，同时要及时送检。 2.7穿刺液:胸腹水、心包液、关节腔液、鞘膜积液: 严格无菌抽取后，注入含肝素抗凝的无菌试管中，轻轻颠倒试管10余次，使肝素与穿刺液混匀达到抗凝的目的，或直接无菌注入血培养瓶内及时送检。 2.8胆汁:由专科医生以无菌方法取引流液10ml注入无菌试管。 2.9脑脊液:以无菌方法取脑脊液3-5ml，置无菌试管内，常温保存送检，如只做培养可直接无菌注入血培养瓶内，及时送检。 2.10生殖器官标本:阴道、子宫颈及前列腺等分泌物应由医师采集，收集于无菌试管内送检。如疑 为淋病奈瑟菌感染，做培养检查时，采集的标本应床旁接种并及时放入孵箱培养。 2.11烧伤标本:以无菌棉拭子直接采取多个部位创面的脓汁分泌物放入无菌试管中. 2.12支原体(解脲、人型)培养+药敏的标本采集 2.12.1.支原体对干、热抵抗力差，标本采集后应尽快接种支原体运送培养基送检。 2.12.2男性:用细的无菌棉拭子沾取无菌盐水少许深入尿道口内2.5-3cm。 3.临床标本的保存 细菌室标本原则上要求及时送检、及时处理，不得保存。 细菌室室内质控失控处理程序 一、BacT/Alert 120血培养仪室内质控处理程序 1( 当BacT/Alert 120血培养仪质控失败时，2( 仪器会提示你对该瓶孔进行定标，3( 通常定标4( 都能通过，5( 只要定标6( 过了，7( 仪器就能正常工作。 8( 如仪器定标9( 不10( 能通过，11( 就要请厂家工程师对仪器进行检测，12( 并对仪器的有关参数进行调整，13( 直到仪器合格后才能进行日常工作并填写失控报告 Vitek-32细菌鉴定及药敏分析仪室内质控处理程序 14( 每批新购买的试剂必须进行室内质控，15( 当质控结果不16( 能符合要求时，17( 应通知组长协助处理，18( 进行失控原因分析。 19( 失控原因分析与处理 2.1 失控的原因分析 2.1.1 自身原因 2.1.1.1 质控菌株、卡片、无菌盐水等出现质量问题。 2.1.1.2质控菌株不符合所检测卡片的要求。 2.1.1.3上卡操作中出现问题，如菌液浓度不准等 2.1.1.4 仪器工作是否正常。 2.1.1.5室温是否符合分析要求。 2.2失控的处理 2.2.1操作不规范时应严格按作业指导书重新检测一次。仍失控进行下一步。 2.2.2检查质控菌株及卡片是否在有效期内，质量如何,无菌盐水是否被污染以及标准菌株是否符合卡片的要求等。在保证质控菌株、卡片、无菌盐水等符合要求的情况下仍失控则进行下一步。 2.2.3做可能影响检测的仪器相应部分保养，仍失控进行下一步。 2.2.4 请仪器工程师分析。 写失控报告。直到质控在控后重新检测。 标本拒收标准 1.支原体培养、鉴定、计数、药敏操作:若送检标本不是运送培养基送检则为不合格标本。 2.找抗酸杆菌:穿刺液标本如发现严重凝固则拒收。 3.脑脊液培养:如标本为非无菌管采集则拒收。 4.中段尿培养:如标本为非无菌管采集则拒收。 5.下呼吸道标本培养:挑取痰标本直接涂片镜检，WBC,10/LP，上皮细胞,25/LP不适合做细菌培养。 6.脓液及创伤分泌物培养:如标本为非无菌管采集则拒收。 7.穿刺液培养:如标本为非无菌管采集则拒收。 8.生殖道分泌物培养:如为淋球菌培养没有直接接种到淋球菌培养基上则拒收。 9.各类培养标本原则上都要求无菌采集并及时送检、及时接种、及时培养，不能保存。除非特殊情况可置于冰箱保存，对分离怕冷的细菌时，应注意标本的保暖。 温度失控处理措施 1.每天上班记录培养箱、冰箱的温度于温度记录本上，如发现普通培养箱的温度超过37?(不包括37?)或低于34?(不包括34?);真菌培养箱温度超过31?(不包括31?)或低于25?(不包括25?);冷藏冰箱的温度超过8?(不包括8?)或低于2?(不包括2?);冷冻冰箱的温度超过-10?(不包括-10?)或低于-30?(不包括-30?)，应立即追溯其失控的时间和原因。 1.1如失控的原因可以马上纠正(如冰箱断电、冰箱门未关好、温控调节器未正确控制、冰箱严重结霜、温度计损坏等)，则由本室人员马上纠正并填写失控报告。 1.2 如冰箱、培养箱本身出现机械故障，本室人员应马上通知维修部或维修商，同时根据排除故障时间的长短是否会对其中的物品质量造成影响而采取相应的措施(如把里面的物品转移到能满足需要条件的环境中)，并填写失控报告单。 2.培养箱中的培养物应全部拿到工作台，检查培养物的生长情况。 2.1. 如果培养基的菌落生长良好，则按常规程序进行检验。 2.2(如果培养基的菌落生长受抑制，则取标本重新接种，如标本确实无法再次接种，则应与临床医生联系、解释并请医生重新采集标本送检。 2.3(如有细菌生长，则应补做药敏试验，并填写《迟发报告单记录表》，并写明原因。 3.故障处理过程中应及时贴上红色标识，并在温度记录本上用红笔记录失控的温度度数，故障处理后应利用培养箱、冰箱的温度调节器，把温度调回到规定范围的中值，并把专业人员的检查的结果记录在仪器档案袋中。另外还需填写《内部质量控制失控报告单》，当温度再次是失控时，再次记录温度的读数，并且上报负责人。 超净工作台 1. 目的 规范净化工作台操作与维护工作，确保仪器正常运作。 2. 适用范围:本实验方法适用于微生物检验中净化工作台操作与维护管理。 3. 检验人员职责:负责此仪器操作和维护管理 4. 操作及维护规程 4.1操作规程 4.1.1使用工作台时，应提前50分钟开机，同时开启紫外杀菌灯，处理操作区内表面积累的微生物，30分钟后关闭杀菌灯(此时日光灯即开启)，启动风机。 4.1.2对新安装的或长期未使用的工作台，使用前必需对工作台和周围环镜先用超静真空吸尘器或用不产生纤维的工具进行清洁工作，再采用药物灭菌法或紫外线灭菌法进行灭菌处理。 4.1.3 操作区内不允许存放不必要的物品，保持工作区的洁净气流流型不受干扰。 4.1.4 操作区内尽量避免作用明显扰乱气流流型的动作。 4.1.5 操作区的使用温度不可以超过60?。 4.2 维护规程及维护方法 4.2.1 根据环境的洁净程度，可定期(一般2,3个月)将粗滤布(涤纶无纺布)拆下清洗或给予更换。 4.2.2 定期(一般为一周)对环境周围进行灭菌工作，同时经常用纱布沾酒精或丙酮等有机溶剂将紫外线杀菌灯表面擦干净，保持表面清洁，否则会影响杀菌效果。 4.2.3 当加大风机电压已不能使风速达到0.32m/s时必须更换高效空气过滤器。 4.2.4 更换过滤器时，可打开顶盖，更换时应注意过滤器上的箭头标志，箭头指向即为层流气流向。 4.2.5 更换高效过滤器后，应用Y09-4型尘埃粒子计数器四周边框密封是否良好，调节风机电压，使操作区平均风速保持在0.32-0.48m/s范围内，再用Y09-4型尘埃粒子计数器检查洁净度。 标本的接种和移种法 接种标本是细菌实验室的一项基本操作技能，目的是使细菌能得到充分的生长和能分离出单个菌落获得纯培养而供分析鉴定之用，所以作此项技术的操作应按以下方式进行: 1.左手的操作要点:左手负责持平板、试管、烧瓶等物品，操作中，左手应尽量减少摆动，否则，不利于保持物品的无菌状态。 1.1左手持物品时，最好固定在一个空间方位上，以避免因移动使空气中的细菌进入器皿，造成随机性污染。 1.2所持的器皿其开口尽量避免向上，持平皿时，可以让平板的表面与地面尽量垂直，试管与器皿烧瓶也可倾斜。当从标本器皿或平板上挑取接种物或菌落后应立即塞上试管塞或扣上平皿，随即接种标本。 2.右手的操作要点:握有接种工具的右手，将接种环或针沿伸到标本之前应作好接种环或针，镊子等工具的火焰消毒工作，待冷却后才沿伸到标本容器中挑取接种物，在挑取标本后，其接种工具应尽量避免接触试管壁及试管口等。随后将接种物在培养基上分离划线。 3.移种或接种的基本步骤: 3.1右手持接种工具，在火焰上烧灼3次灭菌。 3.2左手持起标本容器或原代培养物的平皿或试管等。 3.3用接种工具挑取适量标本或细菌，挑取标本时，应注意选择真实反映感染情况的部分，如粪便挑取粘液脓血部分。纯化细菌应从原代培养物上挑取单个菌落。从液体培养基中取菌，只需将接种环在培养液中蘸取一环即可。 3.4接种时可根据要求采用不同的接种方法。 3.5接种后，应在火焰上反复烧灼接种工具并作一定的编号记录，所用工具应放回原处。 常用分离培养基 1. 常用分离培养基种类:血平板、巧克力平板、麦康凯平板、SS平板、克氏双糖铁(KIA)、M-H培养基、营养琼脂平板、沙保氏培养基、4号培养基、念珠菌药敏平板。 2. 平板培养基均由郑州博赛、杭州天和药业公司生产。 3. 生产批号: 4. 用途: 4.1血平板适用各类细菌生长，为一般细菌标本接种常用培养基。 4.2巧克力平板适用于某些血平板生长不良或需嗜血因子细菌的培养。 4.3麦康凯平板作初步是否发酵乳糖鉴定之用，主要用于粪便标本分离培养及作非发酵菌生长试验用。 4.4 SS平板主要用于粪便标本分离培养及非发酵菌生长试验之用。 4.5克氏双糖铁(KIA)主要用于观察细菌是否发酵葡萄糖、乳糖产气产酸，是否产生H2S及观察动力。 4.6 M-H培养基主要用于药敏试验。 4.7营养琼脂平板用于菌种保存、纯分离及作空气培养。 4.8沙保氏培养基用于真菌培养。 5(质控:每次用标准菌株进行生长试验和抑菌试验质控。质控合格后，方可使用，并认真做好记录。 6(注意事项: 6.1对每批培养基必须检查:平皿的裂纹、充碟不均、培养基裂纹、溶血(血平板)、冷冻、过多的气泡或斑点、污染等。 6.2缺陷性报告:如果发现培养基有缺陷，实验室应做好记录并通知制造商，制造商应有适当的改进措施，并记录在案。 细菌室标本操作流程 1.标本的接受 1.1标本接受的时间:原则上全天任何时间均可。 1.2标本的接受:接受标本者要认真核对标本的数量、标本与检验单要求是否相符以及标本的质量等。 1.3把接受的标本编号。 2.临床标本的接种 2.1检验目的为细菌培养+药敏试验的各临床标本的培养基选择 2.1.1 标本类型 培养基 血 血培养瓶 中段尿 血平板、麦康凯平板、L菌平板 脑脊液 血培养瓶、血平板、巧克力平板 穿刺液 血培养瓶、血平板、麦康凯平板、巧克力平板 胆汁 肉汤、血平板、巧克力平板、麦康凯平板 呼吸道标本 血平板、麦康凯平板、巧克力平板 粪便标本 SS平板、MAC平板和血平板 病灶分泌物 血平板、巧克力平板、麦康凯平板 2.1.2生殖器标本根据临床医生所写的检验项目接种相应的平板及操作:淋球菌培养接种淋球菌平板;念珠菌培养接种沙保罗培养基;支原体培养则按《支原体培养的操作规程》操作;作普通细菌培养,则接种血平板和巧克力平板;衣原体抗原检测的按《衣原体抗原检测的操作规程》进行检验 2.2接种的方法:中段尿标本无菌取10ul，在血平板的中间做垂直划线，然后分离划线。其他标本做分区划线。 2.3检验目的为找抗酸杆菌的按《找抗酸杆菌的操作规程》进行检验。 3.所接种的平板必须写上标本的编号和接种的日期，然后根据要求进行培养。 4.标本的培养条件、温度、时间 平板 培养条件、温度、CO2浓度、时间 血平板 CO2孵箱、35-37?、18-24小时 巧克力平板 CO2孵箱、35-37?、18-24小时 淋球菌平板 CO2孵箱、35-37?、18-24小时 沙保罗平板 CO2孵箱、28-31?、24-36小时 其他的平板 CO2孵箱、35-37?、18-24小时 5.根据生长在平板上的细菌菌落形态、菌落涂片、染色、镜检等来综合判断细菌形态和染色性质，按各属鉴定的作业指导书进行各菌属的常规鉴定及药敏试验。 6.结果的报告 确认细菌鉴定及药敏试验结果后，进行检验验单结果报告的存盘、打印。 7.对各类细菌培养标本除特殊要求外，我室细菌标本在接种后每天按要求进行无害化处理。 二氧化碳培养法 目的是用于分离和培养需CO2气体生长的细菌或只有在CO2环境中细菌生长形态典型的细菌。一般临床细菌实验室须配备一个CO2培养装置，其一为专用的CO2培养箱，其二为烛缸CO2环境。一般实验室两者必须具备其一。我室采用CO2孵箱。做法如下: 调节CO2孵箱正面的温度调节钮，使其温度在35+1?范围。 调节CO2孵箱正面的CO2浓度调节钮，使其CO2浓度在5-10%范围。 将种有标本的平板放入CO2孵箱培养。 关好孵箱门，避免由于门未关好造成的温度、CO2浓度低于允许范围。 分离及纯化法 1.分离是指从原材料或多种细菌的混合培养物中将各种细菌彼此独立地分离开，以得到纯的单一菌株，技术步骤如下: 作纯培养分离时，一般只用一只完整的琼脂平板。涂划多采用分区划线法，在一只平板中可划3,5个区。划法有两种: - 1.1从临床标本分离细菌所含菌数相对较少时，可用接种环取标本涂布在平板一角边缘，然后从此区开始划线至1/3平板，为第一区，再在2、3…区依次划线每划完一个区域均将接种环灭菌一次，冷却后再划下一区域，每一区域的划线均接触上一区域的接种线1―2次，使菌量逐渐减少以获得单个菌落。 1.2快速划线分离法:采用快速划线使一接种环标本能分离出单个菌落，这与标本的菌量及操作者的技能有很大关系。 2.纯化是指欲获得大量纯培养物的方法，所用平板大小可根据需要的菌量而定。方法是将一单个菌落或将相同的菌落作大量密集涂划于平板上而获得大量纯的培养物。 显微镜检查法 显微镜检查是细菌鉴定工作中的一重要手段，有助于细菌的初步鉴别，同时对下一步鉴定工作起着重要的指导作用。有时通过形态学检查可得到初步诊断，如痰中的抗酸杆菌和泌尿生殖道分泌物中的淋病奈瑟菌等。显微镜检查有不染色标本检查法和染色标本检查法两种。 1. 不染色标本的检查:不染色标本主要用于检查细菌的动力及运动状况。 1.1压滴法:用接种环取细菌悬液2环，置于清洁载玻片中央，覆上盖玻片，于高倍镜下观察。制片时菌液要适量，不可有气泡，不可外溢。 1.2 悬滴法:取洁净的凹窝载玻片及盖玻片各1块，将凹孔四周的平面上涂上一层凡士林，取一环菌液置盖玻片中央，将凹窝载玻片的凹面向下，对准于盖玻片的液滴上，然后迅速翻转玻片，用小镊子轻压盖玻片使之与凹孔边缘粘紧。镜下观察时先低倍后高倍，不可压碎盖玻片。有动力的细菌可见细菌从一处移到另一处，无动力的细菌呈布朗运动而无位置的改变。螺旋体由于菌体纤细、透明，需用暗视野显微镜观察其形态、活动。 2. 染色标本检查法:通过对标本的制片及染色，能观察细菌的形态、大小、排列、染色特性以及荚膜、芽胞、异染颗粒等结构，有助于细菌的初步鉴定。 2.1快速革兰染色法 2.1.1操作见试剂说明书 2.1.2结果:革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。 2.1.3 注意事项:染色关健在于涂片和脱色，涂片不宜过厚，固定不宜过热，脱色不宜过度， 菌龄为18,24小时为佳。 2.2抗酸染色法 2.2.1操作见试剂说明书 2.2.2结果:抗酸杆菌呈红色。 2.2.3注意事项:每一张玻片只能涂一份标本且不能在染色缸中染色，以免造成不同标本间的交互污染从而导致阴阳性结果混淆，脱色时间宁长勿短，至无红色液体流下为止。 2.3阿尔培异染颗粒染色法: 2.3.1初染:涂片上滴加第一液染剂(甲苯胺蓝和孔雀绿的乙醇溶液)，染3-5分钟，水洗。 2.3.2复染:第二液染剂(碘化钾溶液)染1分钟，水洗。自然干燥后镜检。 2.3.3结果:菌体呈绿色，异染颗粒呈蓝黑色。 2.3.4注意事项:玻片要清洁，染料需新鲜配制，无沉淀物。注意与标本中的其他杂质相区别。 3.压片镜检，主要观察细菌在组织中的分布。 4.墨汁负染镜检:背景着色而菌体不着色的染色法，用以观察新型隐球菌的宽厚荚膜等。 5.鞭毛染色镜检，观察细菌有否鞭毛、鞭毛的位置、鞭毛的数量，在非发酵菌的鉴定中是一项重要的指标。 6.暗视野镜检:观察一些较微小且有一定结构的微生物，如钩端螺旋体的钩状及螺旋的形态等。 7.制动试验的直接镜检，在标本加入抗血清，观察动力是否被抑制，如霍乱弧菌的制动试验等。 8.荧光镜检，用标有荧光素的物质与检材中的微生物特异结合产生荧光的特点而对微生物作出鉴定。 穿刺液标本的细菌学检验 1. 标本采集 1.1 穿刺液包括胸水、腹水、心包液、关节液及鞘膜液等。 1.2 一般由临床医师以无菌操作穿刺术抽取。胸腹水抽取5,10毫升，心包液、关节液等可抽取2,5m1，将所取得之样本注入含有抗凝剂的无菌管内充分混匀后送检。 1.3 标本采集最好能在停药2天后进行，如不能停药，则应在下次用药前采集，如疑为淋病性关节炎患者，其标本应在采集后立即送检或床边直接接种，切不可放冰箱保存。 2. 检验步骤 2.1 涂片检查 标本3000r/min 离心l5分钟后，取沉淀物制片。 2.2 涂片镜检的细菌常为一般致病菌、革兰氏阴性双球菌和抗酸杆菌等，涂片检查应根据项目要求进行相应的染色镜检。 2.3 培养:作一般细菌培养可把采集的标本接种于血平板、麦康凯、巧克力平板，同时也可将标本注入血培养瓶放入血培养仪培养。 2.4 作厌氧培养可采用直接床边接种标本或采集样本后，将培养物直接注入厌氧增菌培养基。 3. 操作流程 穿刺液 厌氧 涂片革兰氏染色 需氧 注入血培养瓶 厌氧平板 血平板 放入血培养仪 厌氧肉汤 初步报告 麦康凯 阳性报警 巧克力 分离培养 菌落观察 涂片染色 Vitek-32鉴定、药敏/BD凤凰鉴定、药敏 确定报告 4. 报告结果 4.1 涂片报告发现形似某某细菌，淋球菌应报是否在细胞内外发现革兰氏阴性双球菌;抗酸染色应报是否发现抗酸杆菌。 4.2用于培养的穿刺液正常情况下应无菌，如培养出细菌应报细菌种名及药敏试验结果，血培养仪培养6天仍未发现细菌则报无菌生长。 胆汁标本的细菌学检验 胆汁培养常见病原菌 革兰阳性菌 革兰阴性菌 肠球菌 大肠埃希菌 消化链球菌 肺炎克雷伯氏菌 葡萄球菌 变形杆菌 产气肠杆菌 铜绿假单胞菌 伤寒及其它沙门菌 拟杆菌 粪产硷杆菌 2.标本收集 胆汁标本的采集方法有三种，即十二指肠引流法，胆囊穿刺法及手术直接采取法。 2.1十二指肠引流法:在无菌操作下用导管作十二指肠引流胆汁，分为A、B、C三部分。A液来自胆管，为橙黄或金黄;B液来自胆囊，为棕黄绿色;C液来自肝胆道，为柠檬色。一般认为B液做细菌培养意义较大。 2.2胆囊穿刺法:进行胆囊造影时同时采取胆汁。本法所采取的胆汁不易被污染，适宜做细菌培养。 2.3手术采取法:在进行胆部外科手术时直接采取胆汁送检。 3.检验步骤 3.1将送检标本3000r/min 离心30分钟，倾去上清液取沉淀物涂片及培养。 3.2胆汁一般不作涂片检验，如需要应用相应的染色方法检查并仔细观察，因为胆汁沉淀后有较多的内容物复盖而不利于观察细菌。 3.3培养提倡直接将胆汁注入血培养瓶进行增菌培养。培养标本也可直接种血平板、麦康凯平板和巧克力平板。 4.操作流程 胆汁 需氧 血培养瓶增菌 涂片染色 血平板、巧克力平板 血平板、巧克力平板 初步报告 麦康凯 菌落观察 涂片染色 Vitek-32鉴定、药敏/BD凤凰鉴定、药敏 确定报告 5.报告结果 5.1沙门氏菌感染在胆汁中检出率较高，但必须以血清凝集试验为依据报告血清型。 5.2胆汁应是无菌的，如培养出细菌即为致病菌应报细菌的种属及药敏试验结果。 粪便标本的细菌学检验 1.粪便标本中常见病原菌 革兰阳性菌 革兰阴性菌 金黄色葡萄球菌 伤寒及其它沙门菌 结核分支杆菌 志贺菌属 难辨梭菌 致病大肠埃希菌 白色念珠菌 (ETEC、EPEC、EIEC、EHEC) 弧菌属菌种 气单胞、邻单胞菌种 小肠结肠炎耶尔森菌 弯曲菌 2.标本采集 2.1自然排便采集法 自然排便后，挑取脓血、粘膜部分的粪便2,3g，液体粪便取絮状物置于大便培养管或增菌液中送检。 2.2直肠肛管法 用大便培养用的肛管直接插入肛门成人4,5cm，幼儿2,3cm，轻轻在直肠内旋转数次，目的是使直肠表面粘液能通过肛管孔进入肛管内。然后拔出放入大便培养管中送检。 3.检验步骤 3.1涂片检查 粪便标本因各种正常菌群含量甚多而一般不作直接涂片找致病菌，只有怀疑霍乱弧菌及菌群失调所致腹泻时，才作直接涂片检查。 3.2各项的涂片检验均按染色方法进行，但大便检查霍乱弧菌有其处理程序: 3.2.1染色检查:将米泔样的标本涂2张片用乙醇固定后染色，目的观察弧菌有无呈鱼群状排列。 3.2.2悬滴检查 取患者粪便制成悬滴涂片，霍乱弧菌和EI tor弧菌均呈现极活泼的穿梭状运动。 3.2.3制动检验 运动活泼的弧菌涂片加人霍乱弧菌诊断血清后，在显微镜下观察，若原运动活泼的现象停止，为制动试验阳性。 3.3大便标本的培养目的是培养致病菌或追踪病人有否菌群失调现象，无特殊要求作一般致病菌培养的标本接种麦康凯、SS平板各一个。 3.4菌群失调的细菌学检验:选用多种培养基包括SS、麦康凯、血平板、高盐甘露醇盐琼脂平板、Campy-BA血琼脂平板和沙氏琼脂等，目的是使更多的菌群得到生长，以利于检查肠道的细菌情况。 3.5霍乱弧菌的培养，直接取患者米泔样粪便0.5ml，接种于碱性蛋白胨水增菌液和4号平板，35?培养6,8h，再转种一只4号平板。35?培养18,24h后形成较大、菌落中间为灰黑色、有光泽、隆起、湿润的菌落，如泼水状。挑取可疑菌落5,10个与霍乱多价“O”诊断血清作玻片凝集试验，如为阳性，则立即报告，并将可疑菌送成都市疾病控制中心确认。 3.6作结核菌培养应先处理(参照杂菌处理方法篇章介绍)后种入改良罗氏培养基中或magot培养基。 3.7厌氧性难辨梭菌的培养参照厌氧培养。 3.8真菌培养:真菌性腹泻多继发于抗生素治疗后，常见的真菌腹泻多由白色假丝酵母菌引起。将标本接种于沙氏平板及血平板上，置27?和35?培养18,24h，根据形态染色、菌落特征或采用VITEK-32 YBC或API Aux半自动条鉴定，并做ATB Fungus药敏试验。 4.操作流程 粪便或肛拭子 增菌培养 分离培养 涂片检查 沙门氏菌、志贺氏菌 35?18,24h 霍乱弧菌 SS、麦康凯平板 革兰氏染色 观察动力 沙氏斜面、 血平板等 菌落观察 涂片检查 血清学鉴定 Vitek-32鉴定、药敏 /BD凤凰鉴定、药敏 确定报告 5.报告结果:查出肠道致病菌，报告其菌名和药敏结果。如为致病性大肠埃希菌必须以血清学诊断试验为鉴定依据，报告应包括ETEC、EPEC、EIEC、EHEC。 6.粪便中培养出霍乱弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌时应作为危急值报告，并填写几危急值报告单。 血液及骨髓标本的细菌学检验 血液及骨髓标本中常见病原菌 革兰阳性菌 革兰阴性菌 肺炎链球菌 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 伤寒及其它沙门菌 表皮葡萄球菌 变形杆菌 溶血性链球菌 产气肠杆菌 粪肠球菌 肺炎克雷伯氏菌 铜绿假单胞菌 粪产硷杆菌 沙雷氏菌 流感嗜血杆菌 布鲁氏菌 2.标本采集 2.1采血时间:在病人发热初期1-2天内或发热高峰时采集血液标本。采血时间原则上应选 择在抗菌药物应用前,对已用药而又不能中止用药的病人，应在下次用药前采集。 2.2标本采集方法及标本量 成人每次采血10ml，婴幼儿每次采血1-5ml。严格无菌采集的血液标本应立即加入血培养瓶 内，迅速轻摇，使之充分混合，以防血液凝固。对于疑为细菌性骨髓炎病人，应在严格消毒 后抽取骨髓1ml然后注入小儿瓶中进行增菌培养。 3.操作流程 血液 无菌注入 血培养瓶 6天无菌生长 增菌培养 血平板 阳性报警 巧克力平板 无菌生长 发阴性报告 涂片染色 血平板 初步报告 巧克力平板(5%CO2条件) 35-37?，18-24小时 菌落观察、涂片染色及相关酶试验 Vitek-32鉴定、药敏/BD凤凰鉴定、药敏 确定报告 检验科 作业指导书 血液及骨髓标本 的细菌学检验 文件编号:LAB,OP,XJ026 第2页，共2页 版本:1 生效日期:2005-11-01 4. 报告结果 4.1在血液中检出沙门氏菌，必须以血清凝集试验为依据报告血清型。 4.2血液正常情况下应是无菌的，如培养出细菌即为致病菌，应报细菌的种属及药敏试验结 果。 4.3血培养阳性均作为危急值报告，并填写危急值报告单。 编写: 审核: 批准: 批准日期:2005年11月01日 脑脊液的细菌学检验 脑脊液培养常见病原菌 革兰阳性菌 革兰阴性菌 金黄色葡萄球菌 脑膜炎奈瑟菌 A、B群链球菌 卡他布兰汉菌 肺炎链球菌 流感嗜血杆菌 结核分支杆菌 肠杆菌科菌种 产单核李斯特菌 脑膜败血性黄杆菌 新型隐球菌 假单胞菌 白色念珠菌 2.标本收集: 2.1标本必须由临床医师以无菌操作收集脑脊液3,5ml，盛于无菌管中送检。脑脊液中某些细菌(脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌和流感嗜血杆菌等)易死亡，故收集标本后应立即送检。切不可低温(冰箱)保存。 3.检验步骤: 3.1一般细菌涂片检查 除结核性脑膜炎外，由其它细菌引起的化脓性脑膜炎，脑脊液明显混浊，可直接涂片，革兰染色镜检。无色透明的脑脊液，应离心后涂片、染色、镜检，根据染色及形态特征可初步提示细菌的种类。结核分枝杆菌涂片检查:取脑脊液的离心沉淀物(3000r/min,30min)作抗酸染色。新型隐球菌涂片检查:取脑脊液的离心沉淀物作墨汁负染色。 3.2分离培养 用接种环挑取混浊脑脊液或经离心沉淀的沉淀物，分别接种于血平板、巧克力平板，巧克力平板应置于CO2环境中35?培养18,24小时。脑脊液也可直接注入血培养瓶放入BacT/Alert 120或BACTEC 9050中进行监测。 4.检验流程: 脑脊液 3000r/min 10,15min 3000r/min 10,15min 肉眼观察 BacT/Alert监测 培养检查 涂片检查 阳性报警 血平板 巧克力平板(5,10%CO2) 5天无菌生长报阴性 观察菌落 墨汁染色 革兰氏染色 抗酸染色 涂片检查 血清学试验 Vitek-32鉴定、药敏/BD凤凰鉴定、药敏 确定报告 5.报告结果:检出细菌，应报告菌名和药敏结果，血培养仪培养6天仍无生长者则报告阴性。 6(阳性培养结果应作危急值报告，并填写危急值报告单。 尿液的细菌学检验 1.尿液培养常见病原菌 革兰阳性菌 革兰阴性菌 金黄色葡萄球菌 淋病奈瑟菌 肠球菌 大肠埃希菌 A群链球菌 变形杆菌 腐生葡萄球菌 肺炎克雷伯菌 表皮葡萄球菌 产气肠杆菌 结核分支杆菌 沙门菌种 铜绿假单胞菌 沙雷菌 2.标本收集: 2.1尿液标本的采集可采用多种方法:有中段尿采集法、膀胱穿刺法、肾盂尿采集法，而常规是取中段尿作细菌培养。 2.2取中段尿作培养时先要进行前尿道的清洗消毒，以免前尿道寄生菌群污染标本。 2.3如采用其他方法收集标本，必须由临床医生根据临床诊断需要而执行收集术，并在检验单上写明。 3.检验步骤: 3.1涂片检查 3.1.1一般细菌及淋病奈瑟菌涂片:以无菌操作吸取尿液10ml，3000r/min离心15min，去上清液，取沉淀涂片，革兰氏染色镜检，作初步报告。如查见革兰氏阴性双球菌，呈肾形位于细胞内或细胞外，报告“找到革兰阴性双球菌，存在于细胞内外，形似淋病奈瑟菌”。如未查见上述细菌可报告“未发现革兰阴性双球菌”。 3.1.2念珠菌涂片:取尿液沉淀物放于清洁玻片上，覆以盖玻片，制成涂片，用高倍镜检查。革兰染色后，如发现发亮的芽生孢子和假菌丝，就可报告“霉菌孢子及菌丝”。 3.1.3结核分枝杆菌:取尿液10ml，4000r/min离心沉淀30min，取沉淀物涂片，抗酸染色，镜检。如找到红色杆菌，可报告“发现抗酸杆菌”。 3.2一般细菌培养(细菌计数):用定量接种环取尿液10μl接种血平板，35?培养18,24小时，观察有无细菌生长，并计数菌落数，乘以1000，求出每毫升尿液的菌落数。根据菌落特征、涂片染色结果，选择相应的鉴定卡及药敏卡上Vitek-32/BD凤凰全自动细菌鉴定和药敏分析仪,进行鉴定和药敏试验，如培养48小时无菌生长，即报告“无菌生长”。 3.3特殊菌培养: 3.3.1淋病奈瑟菌培养:选用专用巧克力琼脂平板，接种后放入二氧化碳环境中培养。 3.3.2结核菌培养:取沉淀物接种罗氏培养基，35?培养3,4星期，观察有无可疑菌落生长。 4.结果报告: 4.1尿液细菌培养检查必须报告细菌的种属、菌落计数(cfu/ml)及药敏结果。 4.2革兰氏阴性菌落计数大于105cfu/ml，革兰氏阳性菌计数大于104cfu/ml，真菌大于103cfu/ml有诊断意义。 4.3一般常规结核培养要8周方能报告。阳性结果可提前报告。但不做菌落计数只报告“抗酸杆菌生长”的报告，如做了进一步的分型和鉴定，才能报告有××型结核杆菌生长。 4.4用专用培养基培养淋球菌经鉴定可直接报告有淋球菌生长但不做菌落计数，如涂片发现细胞内或外有革兰氏阴性双球菌可报告“发现革兰阴性双球菌”。 4.5如尿液培养同时有三种或以上细菌生长时，可视为污染标本，建议重留送检。 5.操作流程: 尿液3000r/min 10,15min 3000r/min 10,15min 涂片染色 定量培养 细菌计数 观察菌落 淋球菌培养 结核杆菌培养 一般细菌 抗酸杆菌 BD凤凰鉴定、药敏 涂片检查 血清学试验 Vitek32鉴定 淋球菌 药敏 涂片检查 鉴定试验 确定报告 确定报告 脓汁及病灶分泌物细菌学检验 1.脓汁及病灶分泌物培养常见病原菌 革兰阳性菌 革兰阴性菌 葡萄球菌 肠杆菌科细菌 链球菌 假单胞菌 炭疽芽孢杆菌 拟杆菌 破伤风芽孢杆菌 ***谢瓦纳拉菌 产气荚膜梭菌 嗜血杆菌 结核分枝杆菌 产碱杆菌 放线菌、奴卡菌 弧菌属细菌 念珠菌 气单胞菌 2. 标本采集:标本由临床医师行无菌操作术采集，但应注意以下几点: 2.1 闭锁性脓肿 疑为厌氧菌感染时，取材后立即将空气排空，同时针尖插入橡皮塞内防止空气进入，连同注射器一并送检。 2.2 开放脓肿、脓性分泌物可在患部直接用棉拭或纱布擦抹，如为瘘管亦可在无菌操作下取组织碎片分散在无菌盐水中。 2.3 烧伤创面的分泌物，用灭菌棉拭取多部位创面的脓液或分泌物，置无菌试管中送检。 2.4取尿道分泌物必须先清洗、消毒尿道后用挤压法使分泌物从尿道溢出用无菌生理盐水浸湿拭子直接采集标本。如女性做宫颈分泌物细菌培养，应尽量避免杂菌污染。 2.5 组织脏器碎片的收集，先要消毒表面的污染菌，后用无菌刀切开，取内容物及碎片分散于无菌生理盐水中，然后增菌、接种，如活体微量标本可直接放人肉汤增菌培养基中增菌。 3. 检验步骤 3.1涂片检查:脓汁及分泌物标本均应做涂片检查。涂片做革兰氏染色镜检，根据形态和染色特点，可报告“找到革兰氏×性菌，形似××菌”或报告“未发现细菌”。涂片检查包括涂片找细菌、淋球菌、酵母菌等。 3.2 培养 普通细菌培养:标本接种血平板、巧克力平板和麦康凯平板各一只，35?培养18,24小时，根据菌落特性和形态染色，选择相应的鉴定及药敏卡上VITEK全自动细菌分析仪进行鉴定和药敏试验，如培养48小时无菌生长，即报告“无菌生长”。 4.报告结果 4.1涂片报告发现革兰氏×性××菌，淋球菌要报告在白细胞内外是否发现革兰氏阴性双球菌。 4.2对正常无菌部位的感染，从脓汁或分泌物分离到细菌，均有临床意义，按分离鉴定结果报告细菌名称及药敏试验。 5. 操作流程 脓汁、分泌物 涂片染色 需氧培养 (革兰氏染色、抗酸染色等 35-37?18-24小时 (血平板、巧克力、麦康凯) 观察菌落 初步报告 涂片镜检 纯培养 血清学试验 Vitek-32鉴定、药敏 BD凤凰鉴定、药敏 确定报告 生殖系统标本的处理 生殖系统标本培养的主要病原菌 革兰阳性菌 革兰阴性菌 葡萄球菌 淋病奈瑟菌 肠球菌 大肠埃希菌 化脓性链球菌 拟杆菌 厌氧链球菌 铜绿假单胞菌 结核分枝杆菌 变形杆菌 杜克雷嗜血杆菌 标本收集:阴道、子宫颈及前列腺等分泌物应由临床医师采集，收集于无菌试管内送检。 涂片检查: 3.1一般细菌、淋病奈瑟菌和杜克雷嗜血杆菌:革兰染色镜检作初步报告。 3.2结核杆菌:抗酸染色镜检后作初步报告。 4.检验过程: 4.1用棉拭子划完第一区后，用接种环继续分区划线，35?普通培养箱孵育18,24小时，如 有要求培养淋球菌和真菌则加种专用培养基。 4.2流程: 标本 需氧培养 涂片 厌氧培养 血平板 巧克力(CO2环境) 革兰氏染色 厌氧血平板、巧克力 麦康凯平板35?孵育 抗酸染色镜检 平板35?、48小时 分离纯化 涂片染色、Vitek-32鉴定、药敏 BD凤凰鉴定、药敏 鉴定、药敏 血清学试验 血清学试验 确定报告 5.结果报告:报告细菌鉴定及药敏试验结果。 编写: 审核: 批准: 批准日期:2005年11月01日 下呼吸道标本的细菌学检验 1. 下呼吸道标本培养常见病原菌 革兰阳性菌 革兰阴性菌 金黄色葡萄球菌 脑膜炎奈瑟氏菌 化脓性链球菌 流感嗜血杆菌 肺炎链球菌 肠杆菌科细菌 结核分支杆菌 非发酵菌 白喉棒状杆菌 嗜肺军团菌 假丝酵母菌 2.标本收集: 2.1下呼吸道标本采集的基本要求是采集深部的痰液，具体方法有以下几种:1.自然咯痰法2.气管镜采集法3.小儿取痰法4.气管穿刺法5.胃内采痰法。 2.2 标本采集的注意事项 2.2.1标本采集以晨痰为佳，咳前应充分嗽口，减少口腔正常菌群的污染。 2.2.2标本采集后应及时送检，以防某些细菌在外环境中死亡。做结核分枝杆菌或真菌培养的痰液如不能及时送检，应放入4?冰箱，以免杂菌生长。 3.检验步骤: 3.1一般细菌涂片检查 挑取痰液的脓性或带血部分放在两张玻片中，置室温自然干燥，经火焰固定后，做革兰氏染色，另一张根据检验需要做抗酸染色或其他染色。如标本中每个低倍视野内鳞状上皮细胞多于25个，脓细胞又少于10个，并找不到病变部分，表示标本来自唾液，标本不合格，不必进一步检查，要求重新送检。 3.2分离培养 一般细菌培养分别接种于血平板、麦康凯、巧克力平板，巧克力应置于CO2环境中35?培养18,24小时。 4.检验流程: 痰液及支气管分泌物 培养检查 一般细菌 真菌培养 结核分枝杆菌 涂片检查 血平板、麦康凯 沙氏培养基 罗氏培养基 巧克力平板(5,10%CO2) 观察菌落 革兰氏染色 涂片检查 革兰氏染色 抗酸染色 革兰氏染色、相关酶的试验 Vitek-32鉴定、ATB Fungus API Aux 真菌及一般细菌 抗酸杆菌 Vitek-32鉴定、药敏 BD凤凰鉴定、药敏 鉴定及药敏试验 确定报告 5.报告结果:检出细菌，应报告菌名和药敏结果。 API Coryne 系统操作规程 1.对待分离需鉴定菌株，进行革兰染色证实为革兰阳性杆菌、无芽孢、兼性需氧-厌氧生长。观察溶血类型并记录。 2.挑取一个单个菌落于无菌的0.9%氯化钠0.3ml中制备均匀菌悬液，用该悬液注入血平板上，用无菌棉签涂布整个平板表面，于35,37?摄氏度培养24小时。 3.取出API Coryne 系统培养盒，倒入约5ml蒸馏水，造成湿室。记录菌株资料于培养盒上。 4.从包装中取出试验条置盘中，编号。 5.用棉签收集传代培养平板上所有菌，制备浓菌悬液，浊度达大于6个麦氏浊度单位。 6.在试验条的前11个测定(NIT到GEL)杯中均匀注入菌悬液，避免气泡形成。NIT到ESC:每杯接种100,150μl;URE测定:仅注满管;GEL测定:注满管和杯。在试验条最后9个测定(0到GLYG测定:)开启API培养基，并将余下的菌悬液倒入，混匀，并将新制的菌悬液只注入余下反应管内。用矿物油充满有下划线的测定(URE和0到GLYG)杯，形成凸的新月形，盖上盖子。于35?培养24小时。 7.孵育后，加入附加试剂:NIT测定:各加1滴NIT1和NIT2;PYZ测定:1滴PYZ;Pyra、PAL、βGLU、αGLU、βNAG测定:ZYMA和ZYMB各1滴。10分钟后，参考读表判读结果。如果需要，将试验条暴露于强光(1000W)10秒，使Pyra到βNAG管中多余试剂脱色;CAT测定:加1滴过氧化氢(30%)到ESC或GEL测定中，等待1分钟，如有气泡出现，则为阳性结果。 8.鉴定结果可得:用分析图谱索引，所得的反应结果必需编为数值编码。在报告单上，每3个测定归为一组，并分别给予1、2和4的数值。每群中将阳性结果相应的数值相加，得到一个7位数的编码。鉴定结果亦可由键盘手工输入7位编码得到。 9.质量控制:培养基、试验条和试剂由生产厂家进行严格的质量控制。对进行质控实验室，推荐以下标准菌株:类白喉棒杆菌(Corynebacterium pseudodiphtheriticum)、微小杆菌(Exiguobaxterium sp)、格氏李斯特菌(Listeria grayi)、化脓放线菌(Actinomyces pyogenes) RapID ANA?系统操作规程 1.从冰箱取出板条，编号。 2.用接种环挑取足够的菌落，接种至RapID 接种液-2ml(货号8325-102)中制成悬液，相当于3号麦氏浊度标准的浊度。菌悬液充分混匀，悬液应在制备后15分钟内使用。 3.用接种液管中的待测悬液接种一块血平板，35,37?培养18,24小时以备可能需要的附加试验。 4.从板条右上角的“撕口”(“peel to inoculate”)处向左撕开接种板条上的封盖。 5.用无菌加样枪将所有的待测菌悬液移入板条，重新盖上封盖，封好封条。 7.将水平放置的板条向反应孔方向倾斜约45?，轻轻摇动板条直至接种液沿板条后部在各档板间分布均匀，在保持水平位置的情况下，慢慢地朝反应孔方向倾斜板条，直至板条后部所有的接种液沿挡板均匀流入反应孔。检查每个反应孔，所有的反应孔都应没有气泡且充注均匀。 8.将已接种待测菌的板条置35,37?培养4,6小时。 9.按照标准色板的指导从左到右读取并记录第一孔(URE)至第10孔(PO4)的结果。 10.从右下角的标签处向左撕开封盖。在反应孔中加入试剂:在第3(LGY)至9(PYR)孔中加2滴RapID ANA?试剂，在第10号(IND)中滴加2滴INNOVASPOT吲哚试剂，30秒后读取并记录结果，不超过2分钟。 11.RapID ANA?系统的所有试验组合为一组特殊的数字化编码。即将18项试验组成6组，每组3项，从而组成一个6位的数字。阴性结果为0，当试验结果为阳性时，则根据此项试验在组中的位置，第一位为1，第二位为2，第三位为4来表示。然后累加每组中的所有数字，组成一个6位的编码。根据编码号查找RapID ANA?编码手册或ECC电子编码系统确定鉴定结果。 12.用过的RapID ANA?板条、封盖和其它被污染的材料经高压灭菌处理。 13.RapID ANA?系统用索氏梭菌(ATCC 9714)、迪氏拟杆菌(ATCC 8502)、单形拟杆菌(ATCC 8492)作为质控菌株，每一批RapID ANA?板条均应用这三种质控菌株检测。 BacT/Alert 120全自动血培养仪操作规程 1.开机步骤:插上电源，UPS(亮灯稳定)，电脑主机(等绿灯亮)，显示屏，读数箱。 2.关机步骤:关显示屏，电脑主机，读数箱，UPS，拔电源。 3.装瓶步骤:ESC，输入密码password(1111)，选择Load bottles, 根据提示将瓶放入指定的位置，输入病人资料(Enter new data)，按F9存盘，按ESC退出，再按“Log off.” 4.卸瓶步骤:ESC, 输入密码password(1111), 用健盘上下健选择 4.1卸阳性瓶(unload positives)，回车，扫条形码，Log off. 4.2卸阴性瓶(unload negatives)，回车，扫条形码，Log off. 4.3卸无名瓶(unload anonymous bottles), 回车，扫条形码，Log off. 5.如仪器报警显示有阳性瓶，则需将将阳性瓶取出，转种血平板或巧克力平板，转种后再放回全自动血培养仪，待发报告后，再卸载该阳性瓶。根据菌落形态、革兰氏染色镜检结果等，用全自动细菌鉴定/药敏分析仪进行鉴定和药敏试验。 6.注意事项: 6.1装卸瓶时只须扫条码，无需按F9。 6.2阳性瓶转种时不要卸瓶，且要在20分钟内完成，并放回原处。 Vitek-32型细菌鉴定/药敏分析仪 1.取24h内的纯单个菌落配制成菌悬液，按鉴定要求制成不同使用麦氏单位浓度的菌悬液(比浊法)。 2.选好鉴定、药敏卡，编上卡号，接上充填装置。 3.充填:把充填装置放入充填箱，先按ON，再按FILL键即开始充填工作。 4.充填完毕，从荧屏中打开Vitek 查看reader status，了解仪器即将读的卡片架编号。 5.把卡平稳放入仪器即将读的卡片架内，关闭箱门。 6.本机平时不用开关，全日自动工作，当仪器遇需要搬动移位时才可关机。 7.开机，关机步骤: 7.1开机:插上电源，待UPS亮灯稳定、打印机和显示器启动，再打开读数箱2个开关，打开VITEK，点击reader status，点击process on、点击go，查看温度。 7.2关机:点击system，再点击system maintenance，选择stop the system并运行0分钟，按顺序关闭显示器、读数箱、打印机、UPS，最后拔除电源。 8.注意事项: 8.1菌落要纯且新鲜(培养不超过48小时)。 8.2混悬液浓度要符合要求(按VITEK技术指南操作)。 8.3卡里不能混有气泡。 8.4在打开读数箱时，一定要查看荧屏上reader status。 8.5充卡完成后20分钟内要将卡片放进读数箱(YBC、NHI、ANI除外)，否则会影响读数效果。 GPI、GPS操作规程 1.取血平板或巧克力平板上单个菌落制片，做革兰氏染色镜检，为革兰氏阳性球菌或无芽胞杆菌。 2.做过氧化氢酶试验，阳性者记录在卡片上(小圆圈涂黑)。 3.做试管法凝固酶试验:挑取3,5个菌落于稀释人血浆(血浆100μl加0.9%生理盐水300μl)，置35?孵箱内4,6小时记录结果。如凝固酶试验阳性，需将卡片上的椭圆涂黑。 4.从冰箱取出鉴定卡(GPI)、药敏卡(GPS)，待恢复至室温后取出编号，放到卡片架上。 5.浊度计校零及100%，，用装有结晶紫的试管调零，用0.45%的盐水管调100%。 6.挑取经纯化的单个菌落，用浓度为0.45%盐水2ml，配制成0.5麦氏单位浓度的菌悬液，吸取200μl该菌悬液到1.8ml 0.45%的盐水中，用于药敏试验。 7.放入填充箱内填充，待填充完成后用塞子封口，检查和排除气泡。 8.将卡片放入Vitek-32阅读箱内，机器自动读卡。 GNI)GNS操作规程 1.取血平板或巧克力平板上单个菌落制片，做革兰氏染色镜检，为阴性球菌或无芽胞杆菌。 2.做氧化酶试验，阳性者记录在卡片上(空圈涂黑)。 3.从冰箱取出鉴定卡(GNI)、药敏卡(GNS)，待恢复至室温后取出编号，放到卡片架上。 4.浊度计校零及100%，，用装有结晶紫的试管调零，用0.45%的盐水管调100%。 5.挑取经纯化的单个菌落，用浓度为0.45%盐水2ml，配制成1麦氏单位浓度的菌悬液，吸取50μl该菌悬液到1.8ml 0.45%的盐水中，用于药敏试验。 6.放入填充箱内填充，待填充完成后用塞子封口，检查和排除气泡。 7.将卡片放入Vitek-32阅读箱内，机器自动读卡。 NHI操作规程 1.取血平板或巧克力平板上的单个菌落制片，革兰氏染色镜检，为革兰氏阴性球菌或革兰氏阴性杆菌。 2.从冰箱取出鉴定卡(NHI)，待恢复至室温后取出编号，放到卡片架上。 3.浊度计校零及100%，，用装有结晶紫的试管调零，用0.45%的盐水管调100%。 4.挑取经纯化的单个菌落，用浓度为0.45%盐水2ml，配制成3麦氏单位浓度的菌悬液。 5.放入填充箱内填充，待填充完成后用塞子封口，检查和排除气 6.将该卡置37?孵箱，培养18,24h后与标准板对照读取NHI结果，并记录在电脑上由电脑分析结果 7.同时作手工药敏:配制0.5麦氏单位浊度该菌液，用棉签均匀涂于HTM平板上，5min后贴相应药敏纸片(根据NCCLS标准选择药敏纸片)，24h后测量抑菌环大小并报告药敏结果。 YBC操作规程 1.取血平板上的单个菌落制片，做革兰氏染色镜检证实为真菌。 2从冰箱取出鉴定卡(YBC)，待恢复至室温后取出编号，放到卡片架上。 3.浊度计校零及100%，，用装有结晶紫的试管调零，用0.45%的盐水管调100%。 4.挑取经纯化的单个菌落，用浓度为0.45%盐水，配制成2麦氏单位浓度的菌悬液。 5.放入填充箱内填充，待填充完成后用塞子封口，检查和排除气 6.把卡片放在30?的孵箱内孵育18,24小时，然后放入Vitek-32阅读箱内，仪器自动读卡。 7(同时做手工药敏试验:有2种方法 7.1配制0.5麦氏单位浊度该菌液，用棉签均匀涂于念珠菌药敏平板上，待5min后贴相应E-Test药敏纸片，35?培养24,48小时，读取最低抑菌浓度(MIC)并报告。 7.2用0.9%生理盐水配制0.5麦氏单位浊度该菌液，再用0.9%生理盐水1:1稀释，吸取0.5ml菌悬液到念球菌药敏平板，用棉签均匀涂布，弃去多余的菌悬液，放置5分钟后贴药片，35?培养18,24h，测量抑菌环直径并报告。 葡萄球菌属的常规鉴定 1.取平板上的菌落直接涂片、革兰染色并镜检，葡萄球菌为革兰阳性球菌，呈单个、成双或葡萄状排列，菌体呈圆形。 2.在琼脂平板上，成圆形、凸起、边缘整齐、表面光滑、湿润的不透明菌落，可产生脂溶性色素，在血平板上多数葡萄球菌表现为β溶血。 3.触酶试验(3%过氧化氢试验)阳性，发酵葡萄糖产酸试验阳性。 4.血浆凝固酶试验(用混合的人血浆)。取1:4稀释枸橼酸钠抗凝血浆0.5ml，加入3,5个菌落，置35?培养箱4,6小时，观察血浆有无凝固发生。 5.取纯化后的单个菌落，用VITEK 32系统GPI鉴定卡及GPS药敏卡进行细菌鉴定和药敏试验，如有必要加做补充试验。 6.耐苯唑西林的金黄色葡萄球菌为MRSA，耐苯唑西林的凝固酶阴性葡萄球菌为MRSCN。 临床意义:葡萄球菌是人类化脓性感染中最重要的病原菌，能引起多组织、多系统的化脓性感染，另外还可引起脑膜炎、败血症等 链球菌属的常规鉴定 1. 取平板上的菌落直接涂片、革兰染色并镜检，链球菌为革兰阳性球菌，单个、成双或链状排列。无芽胞，无鞭毛。肺炎链球菌为革兰阳性双球菌，呈矛头状，宽端相对，尖端向外，成双排列，有荚膜。 2.最适生长温度为35,37?，在5,CO2环境下生长更好。链球菌在液体培养基中生长时表现为絮状或颗粒状沉淀，易形成长链。在血平板上生长18,24h后可形成直径为0.5,2mm的圆形突起菌落和环绕菌落形成的三种特征性溶血现象:?甲型(α)溶血:即草绿色链球菌;?乙型(β)溶血:即乙型溶血性链球菌，?丙型(γ)溶血:即不溶血链球菌。 3.分离培养常采用羊血平板和巧克力平板，置于5,,10,的CO2环境下培养。 4. 触酶试验(3%过氧化氢试验):阴性 5.杆菌肽敏感试验阳性、胆汁溶菌阴性、CAMP试验阴性可初步鉴定为A群链球菌(化脓性链球菌)。 6.CAMP试验阳性、马尿酸钠试验阳性、β溶血可初步鉴定为B群链球菌(无乳链球菌)。 7.Optochin敏感试验阳性、胆盐溶菌和荚膜肿胀试验阳性，可初步鉴定为肺炎链球菌。 8.胆盐溶菌试验:肺炎链球菌产生自溶。 9.用梅里埃VITEK-32系统 GPI鉴定卡和GPS药敏卡进行全自动细菌鉴定和药敏试验，如有必要加做补充试验。 临床意义:A群链球菌(化脓性链球菌)临床上常引起痈、蜂窝织炎、急性咽炎、丹毒，脓疱疮、猩红热、医源性伤口感染和产后感染等，此外，化脓性链球菌感染后也可发生急、慢性风爆湿热和急性肾小球肾炎等严重变态反应性并发症。肺炎链球菌为口腔和鼻咽部正常菌群，一般不致病，当机体抵抗力下降时，如在寒冷刺激、感冒和麻疹后，可引起大叶性肺炎或支气管肺炎，还可引起化脓性脑膜炎、中耳炎、乳突炎、鼻窦炎、脑脓肿及菌血症和心内膜炎等。近年来耐青霉素的肺炎链球菌及多重耐药菌株的增加，给临床治疗带来一定困难。星座链球菌广泛分布一外部环境，以及人和动物人体表、口鼻腔和肠道，也是化脓性链球菌之一，可引起心内膜炎、肺炎、菌血症、腹腔或皮肤感染。 肠球菌属的常规鉴定 1.革兰阳性球菌，呈单个、成双或短链状排列，卵圆形、无芽胞、无荚膜、部分有稀疏鞭毛。 2.在血平板上可形成灰白色、不透明、表面光滑、中等大小的圆形菌落，在血平板上主要表现为γ-或α溶血现象。 3. 触酶阴性，能在高盐(65g/L氯化钠)、高碱(pH9.6)条件下，40%胆汁培养基上和10,45?的环境下生长，并对许多抗菌药物表现为固有耐药。 4.胆汁七叶苷试验:阳性 5.盐耐受试验:能在含6.5,NaCI的心浸液肉汤中生长。 6.用VITEK 32系统GPI及GPS进行细菌鉴定和药敏试验，如有必要加做补充试验。 临床意义:粪肠球菌主要引起医院感染，最常见为尿道感染，其中大部分与尿道器械操作、导尿等有关;其次为腹部和盆腔等部位的创伤和外科术后感染。近年来，肠球菌属氨苄青霉素耐药株和庆大霉素高耐药逐渐增多，耐万古霉素的肠球菌也有较多报道。 奈瑟菌属的常规鉴定 1.取平板上的菌落直接涂片，革兰染色并镜检。 2.镜下见有革兰阴性球菌，呈卵圆形和肾形，成双或短链状排列。 3.氧化酶试验:阳性。 4.触酶试验:阳性。 5.做营养琼脂生长试验。 6.上梅里埃VITEK32 NHI奈瑟氏菌属鉴定卡，35?培养18,24小时，鉴定。 7.如为淋球菌，用K-B法做药敏试验，用硝基头孢做β-内酰氨酶测定。 布兰汉菌属的常规鉴定 1.取平板上的菌落直接涂片，革兰染色并镜检。 2.镜下见有革兰阴性球杆菌，菌体小，呈成蔟、双、短链状排列。 3.氧化酶试验阳性;触酶阳性。 4.硝酸盐试验:阳性。 5.糖利用试验:阴性。 6.DNA酶试验:阳性。 7.用硝基头孢做β-内酰氨酶测定。 8.用K-B法做药敏，β-内酰氨酶阳性者用红霉素、氯霉素、磺胺类、环丙沙星、四环素、亚胺培南;β-内酰氨酶阴性者用红霉素、氯霉素、头孢菌素、环丙沙星。 临床意义:卡他布兰汉菌是人类和其他动物上呼吸道的正常寄生菌之一，现已证实本菌可引起下呼吸道感染和结膜炎、中耳炎、鼻窦炎、支气管炎，偶尔引起菌血症、心内膜炎、脓胸、脑膜炎、尿道炎等。 棒状杆菌属的常规鉴定 1.取平板上的菌落直接涂片，革兰染色并镜检。 2.镜下见革兰阳性杆菌，菌体一端或两端膨大呈棒状，排列不规则，常呈X、V、L、Y或栅状等多形性，菌体一端或两端可见浓染颗粒(异染颗粒)。 3.触酶:阳性;硝酸盐还原试验:阳性;分解葡萄糖、麦芽糖;蔗糖、尿素酶:阴性。 4.动力阴性;无芽孢。 5. 用API Coryne 系统进行细菌鉴定。 6.调配0.5麦氏浊度单位菌悬液，用 K-B法作药敏试验。 7.35?培养18,24小时后，报告细菌鉴定及药敏结果。 临床意义:白喉棒状杆菌是白喉的病原菌，该菌侵犯口咽、鼻咽等部位，局部形成灰白色假膜。一般不进入血液，产生的外毒素可损害心肌和神经系统，病死率高。本菌还可侵犯眼结膜、外耳道、阴道和皮肤伤口等。