右旋糖酐酶产生菌的筛选、鉴定及酶学性质的研究（可编辑）

右旋糖酐酶产生菌的筛选、鉴定及酶学性质的研究（可编辑） 安徽大学 硕士学位论文 右旋糖酐酶产生菌的筛选、鉴定及酶学性质研究 姓名:岳晓婧 申请学位级别:硕士 专业:生物化学与分子生物学 指导教师:戴玲 2010-06第 1 页 摘要 目录 摘要4 Abstract6 第一章 研究概况..9 1. 右旋糖酐的研究概况..9 1.1 右旋糖酐的结构和理化性质..9 1.2 右旋糖酐的应用..10 2. 右旋糖酐酶的研究概况11 2.1 右旋糖酐酶的定义及分类.11 2.2 右旋糖酐酶的来源.11 2.3 右旋糖酐酶的性质和结构.12 2.4 右旋糖酐酶的基因和一级结构..16 2.5 右旋糖酐酶的应用.19 3. 课题研究背景和内容.20 第二章 右旋糖酐酶产生菌株的筛选.22 1. 材料、仪器与试剂..22 1.1 材料..22 1.2 主要仪器..22 1.3 试剂及其配制22 2. 实验方法..23 2.1 培养基的配制23 2.2 菌株的分离筛选..24 2.3 培养性状..24 2.4 透明圈的比较25 2.5 发酵液酶活测定25 3. 结果与分析..25 3.1 菌株的分离筛选..25 3.2 培养性状..27 3.3 透明圈的比较.29 3.4 发酵液酶活.30 4. 讨论.31 第三章 右旋糖酐酶产生菌的分类鉴定32 1. 材料、仪器与试剂..32 2. 实验方法..32 2.1 培养基的配制32 2.2 培养性状..33 2.3 基因组提取.33 2.4 ITS rDNA扩增34 2.5 感受态细胞制备..35 2.6 连接和转化.36 第 2 页 右旋糖酐酶产生菌株的筛选、鉴定及酶学性质研究 2.7 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 .37 2.8 测序.37 2.9 数据处理..37 3. 结果.38 3.1 D4 菌分类鉴定..38 3.2 D5 菌分类鉴定..42 4. 讨论.46 第四章 右旋糖酐酶酶学性质.49 1.材料、仪器与试剂49 2. 实验方法..49 3. 结果.50 3.1 D4 菌Dex酶学性质研究50 3.2 D5 菌Dex酶学性质研究54 4. 讨论.57 第五章 右旋糖酐酶产生菌的产酶发酵研究.59 1 材料、仪器与试剂59 1.1 供试菌株..59 1.2 主要仪器59 1.3 主要试剂及其配制..59 2 实验方法59 2.1 培养方法..59 2.2 酶活力测定.59 2.3 生物量测定.60 2.4 碳源的影响.60 2.5 氮源的影响.60 2.6 初始pH的影响..60 2.7 装液量、转速、接种量的影响..60 2.8 产酶时间曲线60 3 结果..61 3.1 D4 菌产酶条件研究61 3.2 青霉D5产酶条件研究..63 4 讨论..66 第六章 D5菌株的异麦芽三糖水解酶分离纯化..67 1 材料、仪器与试剂67 1.1 供试菌株..67 1.2 主要仪器67 1.3 主要试剂及其配制..67 2. 实验方法..67 2.1 培养方法67 [101] 2.2 蛋白质浓度测定68 2.3 硫酸铵沉淀饱和度实验..68 2.4 发酵液超滤浓缩..68 第 3 页 Abstract 2.5 硫酸铵沉淀粗酶..68 2.6 DEAE-Sepharose Fast Flow层析..69 2.7 HPLC分子筛69 2.8 Native电泳检测..69 3. 结果.69 3.1 蛋白质 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线..70 3.2 硫酸铵饱和度实验.70 3.3 DEAE-Sepharose离子交换层析70 3.4 HPLC分子筛72 3.5 电泳检测..73 4. 讨论.74 结论.76 参考文献..77 致 谢..85 攻读学位期间发表的学术论文..86 第 4 页 右旋糖酐酶产生菌株的筛选、鉴定及酶学性质研究 摘要 本论文自土壤中分离筛选得到了两株右旋糖酐酶产生菌,对两菌株进行了形 态学的和分子手段鉴定,并研究了该右旋糖酐酶粗酶性质和菌株产酶发酵条件。 研究内容如下: 右旋糖酐酶产生菌株的筛选:采用以右旋糖酐作唯一碳源的筛选培养基,经 过多次筛选和单孢子分离法获得产右旋糖酐酶的单一菌株;通过小室培养法对各 菌丝形态进行观察,结合菌落形态和液态培养形态对各菌株进行初步鉴别;采用 蓝色葡聚糖培养基鉴定各菌株的产酶特性;用 DNS 测还原糖法计算各菌株发酵 液酶活。结果如下:分离筛选获得 5株产酶菌株,分别编号 D1 ~ D5,形态学初 步判断认为 D1 和 D5 为青霉菌,D2 和 D3 为镰刀霉菌,D4 为头孢霉菌。D4 和 D5 菌在蓝色葡聚糖平板上有明显透明圈,酶活测定结果同样显示这两种菌产酶 昀高,因此选择 D4 和 D5 菌进行下一步研究。 右旋糖酐酶产生菌的分类鉴定:分别对 D4 和 D5 菌进行分生孢子、分生孢 子梗、菌落形态,色素颜色等形态学研究,并对菌株的 ITS rDNA 序列进行克 隆 测序,与 GenBank中已知菌的 ITS rDNA 比对,用 Neighbor-joining方法构建聚 类分析树状图,并用 Bootstrap法对其评估。鉴定结果如下:D4 菌的 ITS rDNA 序列与 Verticillium nigrescens 有 99%的同源性,然而该分子鉴定结果不与其形态 学鉴定结果相符,根据更为准确的形态学特征鉴定为头孢霉属。D5 菌通过形态 学分析其为黄绿青霉(Penicillium citreoviride),其 ITS序列的分子鉴定支 持了基于形态特征的鉴定结果,该菌株的 ITS与 Penicillium daleae,Penicillium janthinellum菌株的 ITS rDNA 序列同源性昀高,分别达到 97%和 98%。 右旋糖酐酶酶学性质研究:采用薄层层析法分析右旋糖酐酶降解右旋糖酐、 普鲁蓝糖、淀粉和羧甲基纤维素的酶促产物;通过DNS测还原糖法测酶活,研究 酶的昀适作用温度、热稳定性、昀适作用 pH、pH稳定性,以及金属离子、离子 强度对酶活的影响。结果如下:来自D4、 D5 的右旋糖酐酶均只能降解连续的α-1, 6糖苷键产生异麦芽三糖,对其他糖苷键无作用,证明该酶为外切型异麦芽 三糖 水解酶。该酶具有独特的底物特异性和产物均一性,在理论及应用上具有一定意 义。D4 所产的右旋糖酐酶昀适作用温度为 40?,在 40?半衰期为 80 min,昀适 2+ 2+ 作用pH为 7,在pH 5.6 ~ pH 7范围内稳定,低浓度的Ba 和 Mg 可促进酶活, 150 第 5 页 Abstract ~ 300 mmol/L NaCl所产生的离子强度促进酶活。D5 所产的右旋糖酐酶昀适作用 温度为 55 ?,在 50 ?半衰期为 3 h,昀适作用pH 为 6.5,在pH 4.0 ~ pH 6.5范围 + 2+ 2+ 2+ 内稳定;金属离子K 、Ba 显著促进酶活,Ca 、Fe 强烈抑制酶活;150 mmol/L NaCl所产生的离子强度促进酶活。 产酶发酵研究:通过摇瓶发酵实验和正交实验对两菌株的产酶条件进行了优 化,结果如下:D4 的昀优发酵条件为:培养基中蔗糖、葡聚糖、酪蛋白的质量 分数分别为 1 %、1 %、0.2 %,pH 5.0,接种量 1.5 mL,装液量 80 mL / 250 mL, 转速 120 r/min。25 ?培养 11 d酶活达到 138.11 U/mL。D5 的昀优发酵条件为: 培养基中淀粉、葡聚糖、氯化铵、酵母膏的质量分数分别为 1 %、1 %、0.1 %、 0.1 %,pH 6.0,接种量 1 %,装液量 50 mL / 250 mL,转速 120 r/min。25 ? 培养 13 d酶活达到 176.80 U/mL。 D5 菌所产右旋糖酐酶的分离纯化研究:对发酵 13d 所得的发酵液进行超滤 浓缩,硫酸铵沉淀,DEAE-Sepharose 离子交换层析,HPLC 分子筛层析一系列 的纯化操作,活性电泳和变性电泳结果显示得到两种蛋白质,其中右旋糖酐 酶分 子量为 66kDa。 关键词:右旋糖酐,异麦芽三糖水解酶,菌鉴定,酶学性质 第 6 页 右旋糖酐酶产生菌株的筛选、鉴定及酶学性质研究 Abstract Two dextranase-producing fungi were screened from soil and were identified by morphological and molecular method. The fermentation of those two strains for producing dextranase and the enzymatic properties were studied. The contents were as followsScreening of dextranase-producing microbes: screening medium using dextran as carbon source was adopted; the strains were anticipated to be obtained through series of screening and monospore isolation. The strains were primarily identified according to their colonial morphology, fermentation morphology and hyphae morphology which was observed after cellule cultivation. The enzymatic activity of dextranase from fermentation supernatant was tested using DNS reagent. The results were as follows: five microorganisms were obtained, and were numbered from D1 to D5Through morphology identification, D1 and D5 were considered as Penicillium sp., D2 and D3 were considered as Fusarium sp., D4 was considered as Cephalosporium sp. D4 and D5 formed apparent blank area when they grew in blue dextran plates, and the enzymatic activity test also confirmed that they both had higher enzymatic activity, thus the two strain were selected for the next experimentsIdentification of dextranase-producing species: The morphology of colony, conidiospores and conidiophores of D4 and D5 were studied. The ITS rDNA sequences of the two strains were cloned and sequenced, and then were compared with those available in the GenBank databases. The phylogenetic trees were derived with neighbor joining and analyzed with Bootstrapping. The results showed that the ITS sequence of D4 has a 99% similarity with Verticillium nigrescens, however, the result disagree with the identification based on morphological characteristics. After all D4 was identified as Cephalosporieae sp. according to its decided morphological characters. D5 was identified as Penicillium citreoviride according to its morphological characters, its ITS sequence analysis supported this conclusion. D5 strain had close consanguinities to P. daleae and P. janthinellum, which were 97% and 98%. 第 7 页 Abstract Enzymatic properties studies: hydrolytic products of enzyme released from dextran, pullulan, starch and carboxymethyl cellulose were analyzed by TLC methodEnzymatic activity was measured by DNS reagent, in this way enzymatic properties, such as optimum temperature, temperature stability, optimum pH, pH stability and the effects of metal ion and ionic strength on dextranase were studied. The outcomes showed that the dextranase yielded by D4 and D5 was exo-Isomaltotriodextranase, which hydrolyzed serial α-1, 6 glucosidic bond to release isomaltotriose from dextran while had no effects on other bonds. The enzyme has special substrate specificity and products homogeneity, therefore it is meaningful in theory and application. The enzyme yielded by D4 displayed imum activity at 40 ?; the half-life of the enzyme was 80 min at 40 ?; the optimum pH value was 7, and the enzyme activity was stable from pH 5.6 to pH 7; the enzyme activity was enhanced by low 2+ 2+ concentration Mg and Ba , and the ionic strength of NaCl at 150 ~ 300 mmol/LThe enzyme yielded by D5 displayed imum activity at 55 ?; the half-life of the enzyme was 3 h at 50 ?; the optimum pH value was 6.5, and the enzyme activity was + stable in the range of pH4.0 to pH6.5; the enzyme activity was enhanced by K and 2+ 2+ 2+ Ba , but was inhibited by Ca 、Fe ; the enzyme activity could be improved by the ionic strength of NaCl at 150 mmol/L Fermentation for producing dextranase: The optimum conditions for Isomaltotriodextranase production were studied by flask-shaking fermentation and orthogonal experiments. The optimal condition for D4 strain were as follows: 1 % sucrose, 1 % dextran, 0.2 % casein, initial pH value 5.0, 1.5 mL inoculating quantity, rate of shaking flask with 80 mL liquid in a 250 mL flask was 120 r/min. After fermentation for 11 days at 25 ?, the enzyme activity reached 138.11 U/mL. The optimal condition for D5 strain were as follows: 1 % starch, 1 % dextran, 0.1 % NH Cl, 0.1 % yeast extract, initial pH value 6.0, 1 % inoculating quantity, rate of 4 shaking flask with 50 mL liquid in a 250 mL flask was 120 r/min. After fermentation for 13 days at 25 ?, the enzyme activity was 176.80 U/mLExtraction and purification of dextranase from D5: The supernant of fermentation medium cultured for 13 days was collected and a series of purification processes were 第 8 页 右旋糖酐酶产生菌株的筛选、鉴定及酶学性质研究 carried out: ultrafiltration concentration, ammonium sulfate precipitation , DEAE-Sepharose ion exchange chromatography and HPLC chromatography. The results of SDS-PAGE and Native-PAGE showed that two proteins including the enzyme was gained, the molecular weight of the enzyme was 66kDa KEY WORDS: dextran, isomaltotriodextranase, fungi identification, enzymatic properties第 9 页 第一章 研究概况 第一章 研究概况 1. 右旋糖酐的研究概况 1.1 右旋糖酐的结构和理化性质 右旋糖酐dextran是一种葡聚糖,是葡萄糖主要通过α-1,6糖苷键连接而成的 线形大分子,其主链上有少量 α-1,2, α-1,3 或α-1,4 连接的糖链分支,分子量一般 从数万到数百万不等。已报道一些微生物具有合成右旋糖酐的能力:根霉菌 [1] (Rhizopus) 、明串珠菌(Leuconostoc)和链球菌(Streptococcus)的一些种类 [2-3] 产生右旋糖酐蔗糖酶(dextransucrase, EC2.4.1.5),可将蔗糖合成右旋糖酐。 其他一些细菌,如醋杆菌(Acetobacter),产生糊精右旋糖酐酶(dextrindextranase, [4] EC2.4.1.2),可转化糊精为右旋糖酐 。肠膜样明串珠菌( Leuconostoc [5-8] mesenteroides) 需要以蔗糖诱导其合成右旋糖酐的能力,而链球菌属则不需 要在培养基中加入蔗糖也能合成右旋糖酐蔗糖酶。目前工业上主要采用蔗糖为碳 源,由肠膜明串珠菌发酵生产右旋糖酐。 右旋糖酐呈无臭无味的白色粉末状,其理化性质和用途与其分支度和分子量 [9-10] 密切相关 。低分子量右旋糖酐易溶于水,随着分支程度和分子量增加,右旋 糖酐在水中的溶解度减少。研究发现,当α-1,3 糖苷键连接的分支含量大于 43% [10] 时,右旋糖酐是不溶性的 。不同的微生物菌株,不同的生长速度和生长环境导 [7, 11-14] 致微生物合成不同分支程度,分支位置,分支长度和分子量的右旋糖酐 。 [3] 右旋糖酐蔗糖酶可合成含 50%以上α-1,6 糖苷键的右旋糖酐 ,其中研究昀多的 是被用于工业生产的肠膜明串珠菌所产生的右旋糖酐蔗糖酶,该酶合成的线形右 [15] 旋糖酐分子为可溶性,含有约 5%的α-1,3 糖苷键所连接的支链 ,这些长支 链很 [16] 大程度上影响右旋糖酐的性质 ;另有些肠膜明串珠菌所产生的右旋糖酐蔗糖酶 [11] 可将葡萄糖合成水不溶或低溶解度的葡聚糖 。链球菌合成的葡聚糖可分为两 类:一类是右旋糖酐,主要由 α-1,6 糖苷键构成;另一类是不溶于水的葡聚糖, [3, 17] 其含有超过 50%的α-1,3糖苷键,而α-1,6糖苷键和α-1,4糖苷键的含量较少 。 链球菌OMZ176 菌株合成的葡聚糖含有高达 90%的α-1,3 糖苷键,这种葡聚糖又 称变聚糖。Hare等人报道的链球菌,其合成的葡聚糖含有等量的 α-1,3 糖苷键和 [18] α-1,6 糖苷键 。这一类水不溶性的葡聚糖,在早期的研究中也被称为右旋糖酐 [19] 。 第 10 页 右旋糖酐酶产生菌株的筛选、鉴定及酶学性质研究 右旋糖酐的分子量范围差异很大,其中有以下几种类型,M90kDa的为高分 子, M50kDa~90kDa的为中分子, M25kDa~50kDa的为低分子和 M10kDa~25kDa的为小分子,M10kDa的为微分子。工业上发酵肠膜明串珠菌 所产生的右旋糖酐,范围不均一从小分子寡糖到数千万分子量的聚糖,通过升高 温度及强酸水解可降低其分子量,经过长时间水解可得到葡萄糖。通过酶水解聚 糖,可获得不同分子量的右旋糖酐,异麦芽糖寡糖,葡萄糖等产物混合物,根据 酶的不同而产生不同的酶解产物。不同分子量的右旋糖酐有不同的体内作用,通 常将分子量均一的,大小低于 70kDa的右旋糖酐称为医用右旋糖酐clinical [10] dextran 。 1.2 右旋糖酐的应用 右旋糖酐有广阔的应用前景。中等分子量的医用右旋糖酐胶体液可作为血浆 代替品,静脉注射后能提高血浆渗透压,吸收血管外水分,从而具有扩充血容量, 维持和升高血压的功效,临床可供出血及外伤失血过多引起的休克的急救。低分 子及小分子的医用右旋糖酐可使已经聚集的红细胞与血小板解聚,有效改善 微循 环,降低血液粘性,可用于血栓性疾病如脑血栓,心绞痛,脑供血不足,眼底动 脉栓塞等的预防和治疗,也可用于预防和消除肢体再植和血管外科手术的术后血 栓。与高分子量的右旋糖酐相比,低分子量的右旋糖酐对于引发过敏反应的风险 较低。目前市售的用于临床的主要有三种规格:右旋糖酐 20(MW 16000~24000), 右旋糖酐 40(MW 32000~42000),右旋糖酐 70(MW 64000~76000)(见中国 药典 2005版以及相关医药产品。 右旋糖酐以其良好的水溶性、低毒、相对化学不活跃性,常被选作药物载 体。从九十年代开始关于纳米级右旋糖酐药物载体的研究十分活跃,Basan等人 [20-21] 用修饰的右旋糖酐构建纳米级药物载体 。 右旋糖酐还具有其他应用领域。荧光标记的右旋糖酐(FITC-dextran)可示 踪经囊泡融合,电转移或微注射载入细胞的大分子,以及示踪细胞吞噬和内化外 [22-23] 源性物质的过程和途径 。在食品工业上,可用于浓糖浆或糖果的制造中,当 糖液中右旋糖酐含量高于 0.04%时,会使蔗糖结晶时在 2个晶轴方向的生长受到 [24] 抑制,从而晶体伸长,蔗糖的结晶受到阻碍 。此外,低热的右旋糖酐还可作为 食品添加剂,用于多种食品饮料的生产。 在石油工业中,可作为油井钻泥添加 [25-26] 剂,加 20‰左右的dextran能阻止水份的损失,有利于在井壁上形成薄层 。 第 11 页 第一章 研究概况 2. 右旋糖酐酶的研究概况 2.1 右旋糖酐酶的定义及分类 已发现一些微生物能合成水解 dextran的酶类,泛称右旋糖酐酶dextranases, dex。依据催化反应类型,右旋糖酐酶又可分为内切酶(endodextranase)和外切 酶(exodextranase)。内切酶随机内切水解 dextran的 1,6糖苷键,水解产物主 要是异麦芽糖、异麦芽三糖、葡萄糖和异麦芽寡糖的混合物,视产酶微生物的来 源不同和底物不同而有差别。外切酶是从右旋糖酐链的还原端或非还原端依次顺 序移去末端 1-3个葡萄糖,产物分别为葡萄糖、异麦芽糖、异麦芽三糖。 国际生物化学联合会(IUB-MB)将糖苷酶分为三类: O-和 S-糖苷的水解 酶属 EC.3.2.1.X,N-糖苷的水解酶属 EC.3.2.2.X,除以上两种以外的非定型糖苷 水解酶属 EC.3.2.X.。催化降解 dextran的酶属于第一类,这些酶被划分为以下几 种,分别是内切右旋糖酐酶(endodextranase)(EC 3.2.1.11),葡萄糖右旋糖酐 酶(glucodextranase) (EC 3.2.1.70),异麦芽糖右旋糖酐酶isomaltodextranaseEC 3.2.1.94和异麦芽三糖右旋糖酐酶isomaltotriodextranase(EC 3.2.1.95)。这是 一种传统的分类法,主要是按照酶底物特异性和催化反应的类型来命名,其限制 性在于它不适用于可以催化两种以上底物的酶,更不能体现酶与酶之间的进化关 系。 1991年,Henrissat等人提出了另一类分类法,他们根据已公示的蛋白质氨基 酸序列和空间结构的同源性结合传统分类法,将糖苷水解酶和糖基转移酶 (transglycosidases)按家族分类,建立了CAZy Carbohydrate Active Enzymes数 [27] 据库 见 ////0>. 。在CAZy数据库的分类中,有着相同底物专 一性的右旋糖酐酶有可能属于不同的家族,而同一家族当中可包含有不同底物特 异性的糖苷酶。该分类系统与酶的分子机制和结构相关,受到科学界的广泛接受, 目前作为IUB-MB分类法的补充成为糖苷酶的结构分类的标准方法。 Dextran水解酶归属至糖基水解酶(GHs)的 5个家族(49、66、13、15、27) [28] 。葡萄糖右旋糖酐酶(EC 3.2.1.70)被划分到家族 13和 15,异麦芽糖右旋糖 酐酶EC 3.2.1.94和异麦芽三糖右旋糖酐酶(EC 3.2.1.95)分别归属至 27 和 49 家族,内切型右旋糖酐酶则归属至 49和 66家族。 2.2 右旋糖酐酶的来源 第 12 页 右旋糖酐酶产生菌株的筛选、鉴定及酶学性质研究 很多微生物产Dex,已报道的产酶细菌主要有以下几个属:假单胞菌属 (Pseudomonas)、 短杆菌属(Brevibacterium)、链球菌属(Streptococcus)、 拟杆菌属(Bacteroides)和杆菌属(Bacillus),其中关于链球菌属的研究昀多, 而杆菌属中的产酶枯草杆菌也多见报道。 产酶真菌大多数是青霉菌 (Penicillium),其次是斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi),其他被报道的 真菌有肉色曲霉(Aspergillus carneus),申克孢子丝菌(Sporotrix schencki)和 [29] 细丽毛壳菌(Chaetomium gracile),镰刀菌属(Fusarium)等 。表 1 右旋糖 酐酶产生菌株及其酶解产物 Tab.1 Dextranase-producing strains and enzymatic products 酶解产物 产酶微生物(内切酶) [30] 葡萄糖,异麦芽糖,异麦芽四糖,异麦 Lipomyces starkeyi KSM22 芽寡糖 [31] 葡萄糖,异麦芽糖,异麦芽三糖,异麦 Aspergillus carneus , Chatomium [32] [33] 芽寡糖 gracile ,Bacteroides oralis Ig4a [34] 葡萄糖,异麦芽糖,异麦芽寡糖 Sporotrix schencki ,Pseudomonas sp[35] [36] .,Paenibacillus illinoisensis [39] 葡萄糖,异麦芽糖,异麦芽三糖,异麦 Penicillium lilacinum , Penicillium [40-41] 芽四糖 notatum ,Lipomyces starkeyi ATCC [42-43] [44] 葡萄糖,异麦芽三糖 Flavobacterium sp[47] 葡萄糖,异麦芽糖 Cytophaga sp[45] 异麦芽糖,异麦芽三糖,异麦芽寡糖 Penicillium acualeatum,Fusarium sp. [46] 异麦芽糖,异麦芽三糖 Thermotoga lettingae [29] 异麦芽糖 Penicillium funiculosum [29] 异麦芽三糖 Streptococcus mutans K1-R 酶解产物 产酶微生物(外切酶)[29] 葡萄糖,异麦芽糖,异麦芽五糖,异麦 Pseudomonas sp.strain UQM733 芽六糖,异麦芽寡糖 [29] 葡萄糖 Streptococcus mitis ATCC ,Lipomyces [29] lipofer IGC 4042 [47-48] 异麦芽糖 Arthrobacter globiformis T6 [49] 异麦芽三糖 Brevibacterium fuscum ,Alcaligenes [50] sp 2.3 右旋糖酐酶的性质和结构第 13 页 第一章 研究概况 表 2 右旋糖酐酶分子量 Tab.2 Molecular weight of dextranase 酶分子量(kDa) 微生物菌种 参考文献 重组酶 天然酶 Streptococcus sobrinus 80~130 160~260 [51] Streptococcus mutans Ingbritt 内切型 ?? 70, 105, 20 [52] Streptococcus salivarius PC-1 70, 90, 190 110 [53] Arthrobacter sp. Strain CB-8 ?? 62 [54] Streptococcus mutans Ingbritt(外切型) 88,104, 118, 96, 108,167 [55-56] 133 Streptococcus salivarius M-33 ?? 86 [57] Penicillium minioluteum HI-4 67 ?? [58] Streptococcus suis ?? 62 [59] Bacillius circulans T-3040 110 ?? [60-61] Arthrobacter globiformis T-3044 120 ?? [62] Arthrobacter globiformis T6 ?? 66 [63] Brevibacterium fuscum var. dextranlyticum 68 ?? [64] strain 0407 Streptococcus downei 210 220 [65] Streptococcus rattus ?? 100 [66] 2.3.1 产自细菌的内切右旋糖酐酶 产自链球菌的内切右旋糖酐酶(EC 3.2.1.11),分子量大小差异很大,范围 从 15 kDa ~ 220 kDa,等电点通常为 4 ~ 6 之间,因此分离纯化蛋白通常采用阴 离子交换柱和琼脂糖分子筛等。 [66] 根据SDS-PAGE的条带显示,S. rattus的右旋糖酐酶分子量为 135 kDa ,比 由氨基酸序列推测得出的分子量大(97.6 kDa),这种现象在其他一些来自口腔 链球菌的右旋糖酐酶中同样存在,分子量的差异问题原因不明。酶的pI为 4.67, 昀适作用温度为 40?,pH为 5.0,与来自S. mutans和S. sobrinus的酶的性质类似。 [65] 来自S. downei 的右旋糖酐酶分子量为 139.7 kDa,pI为 4.49。 根据基因序列预计S. criceti的右旋糖酐酶分子量为 128.1 kDa,pI值为 4.15, 为细胞表面蛋白。细胞提取物中存在分子量分别为 200和 180 kDa的两种 酶,存 在于胞外培养基中的酶分子量为 180 kDa,推测原因可能是胞外酶为dex的一种成 [67] 熟形式 。比较来源于几种链球菌的右旋糖酐酶酶活大小发现,来自S. sobrinus 的酶是来自S. criceti的酶活性的 39倍,S. criceti的右旋糖酐酶活性在口腔链球菌 [68] 中则是昀低 。 第 14 页 右旋糖酐酶产生菌株的筛选、鉴定及酶学性质研究 一种芽胞杆菌(Bacillus),所产的胞外右旋糖酐酶经过分离纯化后得到 3 [37] 种同工酶,分子量分别是 76,89,110kDa,等电点分别是 4.95,4.2,4.0 。这 三种酶的复合体有一个较宽的昀适pH 范围,大约在pH6.8左右,昀适温度是 50?。 [37] 产自Paenibacillus illinoisensis的右旋糖酐酶,同样发现了 3种同工酶 ,分子量 范围为 15 ~ 20 kDa。研究发现,高分子量的右旋糖酐酶更容易在贮存中失活, [52] 而较低分子量的右旋糖酐酶则通常无影响 。 2.3.2 产自真菌的内切右旋糖酐酶 产自真菌的内切右旋糖酐酶(endodextranase)可随机降解 dextran 的 α-1,6 糖苷键,产生异麦芽糖、异麦芽三糖、葡萄糖和异麦芽糖寡糖的混合物。不同微 生物来源的右旋糖苷酶的底物专一性也不同。 2.3.2.1 斯达氏油脂酵母的右旋糖酐酶 [69] David 等人 对L. starkeyi产右旋糖酐酶的诱导研究表明, 1-O- β-葡萄糖甲苷 (BMG),1-O- α-葡萄糖甲苷(AMG),葡聚糖,异麦芽糖,异麦芽三糖,异麦 芽四糖可以诱导酶的产生。其中,BMG作为诱导剂的效果昀好,其次是葡聚糖; AMG,异麦芽糖,异麦芽三糖,异麦芽四糖的诱导效率是葡聚糖的 65%。诱导 时间也对产酶量有影响,随着时间延长产酶量增多,BMG的诱导作用时间可达 11 小时,而AMG和葡聚糖的诱导作用可延续 8 小时。AMG,BMG,葡聚糖作 为诱导剂的饱和剂量是相等的,但产酶量不同。 [70] L. starkeyi的基因表达酶dex,只存在一条氨基酸链,酶的分子量为 70kDa 。 经NetNGlyc 1.0 预测该酶存在 5个N-糖基化位点,因此对纯化后的糖苷酶进行去 糖基化处理后,再次测分子量为 66kDa,与序列预测结果(66.4kDa)一致。该 3+ 2+ 3+ 酶的昀适温度和pH 分别为 30?和 4.5,金属离子Al ,Cu ,Fe 以及SDS完全抑 2+ [43] 制了酶活性,而Mg 增强酶活至 145%。这与Koenig报道 的L. starkeyi的天然酶 性质有差异,其昀适温度为 55?,昀适pH 为 5.0。推断可能是由于C-末端的组氨 酸标签改变了酶的立体结构,因此改变了酶的性质,使其与自然分离的酶性质有 所不同。 [71] Hee-Kyoung等人 报道的L. starkeyi基因表达酶dex昀适温度和pH 为 37?和 2+ 3+ 2+ 6.0。1 mM的Hg ,Ag , Mn 对酶的活性有强抑制作用。该酶还可以水解可溶性 淀粉和变聚糖,其水解活性分别是水解右旋葡聚糖的 22%和 8%。 这表明该酶 有着广泛的底物范围,可降解大部分的α-1,6糖苷键,一部分α-1,3和α-1,4 糖苷键。 第 15 页 第一章 研究概况 2.3.2.2 青霉的右旋糖酐酶 [72] 对青霉中右旋糖酐酶的诱导表达研究发现 ,使用右旋糖酐作为碳源时构建 的基因工程菌株高表达右旋糖酐酶,而在使用淀粉,葡萄糖,甘油,乳糖和山梨 醇作为碳源的培养基中该工程菌不表达酶。如果在已含有右旋糖酐的培养基中加 葡萄糖或甘油,则使该菌株右旋糖酐酶基因转录延迟 24 小时。这表明葡萄糖和 甘油阻碍酶的合成, P. minioluteum右旋糖酐酶基因的表达在转录水平上受碳源的 调控。 Li等人研究发现,来自P. minioluteum酶基因不能在Saccharomyces. cerevisiae 中有效地分泌到胞外,如果在酶上增加S. cerevisiae的α因子前导序列则成熟的酶 [73] [74] 可以穿过胞膜 。同样的现象在Roca等人 的研究中也被观察到, 用S. cerevisiae 表达酶基因其结果是培养液中的酶活性很低,说明S. cerevisiae不能有效地表达分 泌异源的右旋糖酐酶。当加上S. cerevisiae的信号肽序列SUC2 后,酶在Pichia pastoris中则能被高效地表达分泌出来,如果没有信号肽则大多数右旋糖酐酶结 合于细胞壁上。 2.3.3 外切右旋糖酐酶 葡萄糖右旋糖酐酶(EC3.2.1.70)可从右旋糖酐还原端外切产生葡萄糖,目 [75] 前该酶只在细菌和酵母中发现过。在菌株Arthrobacter globiformis strain I42 和 [62] T-3044 中发现了该酶,菌株I42 所产的酶既可以外切右旋糖酐和异麦芽糖,也 可外切淀粉,麦芽糖,黑曲霉糖,曲二糖产生葡萄糖,该酶降解 α-1,6糖苷键的 [76] 酶活高于降解α-1,4 糖苷键的活力 。这说明葡萄糖右旋糖酐酶的功能会随反应 条件不同而不同。 异麦芽三糖右旋糖酐酶isomaltotriodextranase(EC3.2.1.95)昀早由 Sugiur [49] 发现 ,是由Brevibacterium fuscum var. dextranlyticum产生的外切酶。该酶的底 物特异性较强,只降解具有连续 1, 6糖苷键的右旋糖酐产生异麦芽三糖。 Takafumi [77] 等人 克隆了来自Brevibacterium fuscum var. dextranlyticum strain 0407 的异麦芽 三糖右旋糖酐酶基因并在大肠杆菌中表达,该重组蛋白为 68.3 kDa,和他们从野 生菌发酵液中分离纯化的天然蛋白分子量 70 kDa基本一致。通过酶学性质研究 发现,该重组蛋白的昀适作用pH 和天然蛋白是一致的,均为pH7.5;然而重组蛋 白酶活为 21.5 U/mg,仅为天然蛋白酶活的 40%(54.7 U/mg);动力学参数也有 所不同,重组蛋白K 0.72 mg/mL,天然蛋白K 0.26 mg/mL,该参数改变的 m m 第 16 页 右旋糖酐酶产生菌株的筛选、鉴定及酶学性质研究 原因尚不清楚,对此Takafumi推测是由于天然蛋白需要移除信号肽以分泌到胞 外,而重组蛋白不需要此过程,从而有可能导致了动力学参数改变。 2.4 右旋糖酐酶的基因和一级结构 所有Dex 蛋白的分子结构有其共性即都主要由5 部分组成:N- 末端信号肽 (Sp)、C- 末端膜结合区域(MAR)、一个不变区(CR)和两个可变区(VR)。 [78] 不变区约位于整个肽链的中间位置,其两侧是两个可变区 。 2.4.1 产自细菌的内切右旋糖酐酶 Streptococcus criceti, Streptococcus mutans, Streptococcus rattus, Streptococcus sobrinus, Streptococcus downei和Streptococcus salivarius的右旋糖酐酶都属于糖基 水解酶家族66。S. mutans,S. rattus,S. sobrinus,S. downei和S. salivarius的酶氨 基酸序列与S. criceti比对结果显示,其同源性分别是50.8%, 50.6%, 61.2%, 63.9%, [79] 42.0% 。 [79] S. criceti的dex基因开放阅读框编码1200个氨基酸 ,与来自S. downei的酶序 列有63.9%的同源性,其中的中间区域(氨基酸残基136-828)有83.8%的同源性。 阅读框之前存在一个可能的核糖体结合位点AGGAGA。Southern杂交分析得知 dex在基因组中是单拷贝。用Signal P3.0分析得知N-末端的26个氨基酸应为信号 肽,C-末端存在一个胞壁分选信号LPXTG基序(氨基酸残基1169-1173),一个 疏水区域(氨基酸残基1176-1195),和一个带电荷的尾部,推测该酶为细胞壁 锚定蛋白。S. criceti的催化位点是一个高度保守区域, 12个残基 (FDGWQGDTIGDN),位置在氨基酸447-458,与其他来自口腔链球菌的右旋 [80] 糖酐酶一致,这点在Igarashi等人 的工作中也被证明。预测的葡聚糖的结合区 在682-798位共117个氨基酸,点突变研究发现Asp453在S. criceti中是酶催化的活 性位点。酶的C端可变区cVR和膜结合区,与酶活性无关。