primer5和Oligo结合设计引物步骤及心得

primer5和Oligo结合设计引物步骤及 心得 信息技术培训心得 下载关于七一讲话心得体会关于国企改革心得体会关于使用希沃白板的心得体会国培计划培训心得体会 primer5和Oligo结合设计引物步骤及心得(图) 一、引物设计step by step 1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。 2、用Primer Premier5搜索引物 ?打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内(选择As)，此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。 此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引? 物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可 500bp. 以适当变化，因为100,200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择 300,?点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分(Rating)排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。 ?对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况: 3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或 CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括:T应该在55,m70度之间，GC,应该在45,,55,间，上游引物和下游引物的T值最好不要相差太多，大概m 在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色， 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5. ?在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。 3、用Oligo验证评估引物 ?在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列(在primer中，该序列已经被保存为Seq文件)，会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability(Delta G)窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置(Primer5已经给出)即可，而引物长度可以通过点击Change,Current oligo length来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze菜单中各种强大的引物 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 功能了。 ?Analyze中，第一项为Key info，点击Selected primers，会给出两条引物的概括性信息，其中包括引物的T值，此值Oligo是采用nearest neighbor method计算，会比Primer5中m 引物的Tm值略高，此窗口中还给出引物的Delta G和3’端的Delta G.3’端的Delta G过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过9。 ?Analyze中第二项为Duplex Formation，即二聚体形成分析，可以选择上游引物或下游引物，分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择Upper/Lower ，即上下游引物之间的二聚体形成情况。引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素，因此应该避免设计的引物存在二聚体，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其Delta G值应该偏低，一般不要使其超过4.5kcal/mol，结合碱基对不要超过3个。Oligo此项的分析窗口中分别 给出了3’端和整个引物的二聚体图示和Delta G值。 ?Analyze中第三项为Hairpin Formation，即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物，同样，Delta G值不要超过4.5kcal/mol，碱基对不要超过3个。 Analyze中第四项为Composition and T，会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组m 成比例和Tm值。上下游引物的GC,需要控制在40,,60,，而且上下游引物之间的GC, 不要相差太大。Tm值共有3个，分别采用三种方法计算出来，包括nearest neighbor method、,GC method和2(A，T)，4(G，C)method，最后一种应该是Primer5所采用的方法，T 值m可以控制在50,70度之间。 第五项为False Priming Sites，即错误引发位点，在Primer5中虽然也有False priming分析，但不如oligo详细，并且oligo会给我正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使误引发效率在100以下，当然有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到400,500，错误引发效率超过100幅度若不大的话，也可以接受。 ?Analyze中，有参考价值的最后一项是“PCR”，在此窗口中，是基于此对引物的PCR反应Summary，并且给出了此反应的最佳退火温度，另外，提供了对于此对引物的简短评价。若该引物有不利于PCR反应的二级结构存在，并且Delta G值偏大的话，Oligo在最后的评价中会注明，若没有注明此项，表明二级结构能值较小，基本可以接受。 ?引物评价完毕后，可以选择File,Print，打印为PDF文件保存，文件中将会包括所有Oligo软件中已经打开的窗口所包括的信息，多达数页。因此，打印前最好关掉Tm窗口和Delta G窗口，可以保留引物信息窗口、二级结构分析窗口(若存在可疑的异常的话)和PCR窗口。 4、引物确定后，对于上游和下游引物分别进行Blast分析，一般来说，多少都会找到一些其他基因的同源序列，此时，可以对上游引物和下游引物的blast结果进行对比分析，只要没有交叉的其他基因的同源序列就可以。 二、引物设计过程中的心得 1、Primer 5.0搜索引物 ?Primer Length我常设置在18,30bp,短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。 ?PCR Product size最好是100,500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。 ?Search parameters还是选Manual吧，Search stringency应选High，GC含量一般是40,60,。其它参数默认就可以了。 ?搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估。当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3端?2个A或T,或引物内部连续的G或C太多，或引物3端?2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。对于这样的引物，如果其它各项指标还可以，我喜欢在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。 2、Oligo 6.0评估引物 在analyze里，Duplex Formation不管是上游引物、下游引物还是上下游引物之间，The most ? stable 3’-Dimer绝对值应小于4.5kcal/mol, The most stable Dimer overall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温度有关，我几次实验感觉在PCR退火温度在65?的时候，The most stable Dimer overall 6.7kcal/mol没有问题。 ?Hairpin Formation根据黄金法则 ?False priming sites: Primer的priming efficiency应该是错配地方的4倍左右，更多当然更好。 ?在PCR栏，丁香园战友感觉其所显示的optimal annealing temperature数值值得参考。在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。 ?Internal stability很重要:我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。 下图引物3端过于稳定，很容易导致不适当扩增。?G参照黄金法则，这其实很好理解:把一滴水放到大海里，这滴水就会不停的扩散分布，扩散的越厉害越稳定，所以?G绝对值越大结构越稳定。 3、其他 ?两个评价系统不一样，丁香园战友感觉oligo评价引物好点，primer出来的引物，一般按效率排序，再结合退火温度和引物长度，选择引物到oligo测试。这是初步的选择，其实引物到了oligo里，退火温度也不一样。 ?3端的二聚体应该避免，这个要看退火温度决定，一个50?的退火温度肯定和65?对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在,4.5kcal/mol以下(丁香园战友观点，很多东西真得还是需要自己摸索)。 ?丁香园战友感觉3端有A无A影响不大，3端有T是不是一定不行，不见得。软件是评估，法则也不是没有例外，不是1，1,2那么确定。 ?错配和二聚体谁轻谁重，丁香园战友觉得“到致命的程度”谁都重要，在设计的时候，尽量两个都不得罪。 ?GC含量并非不重要，它直接影响引物各端稳定性，3端来两个G或C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。所以丁香园战友设计引物的时候，会尽量避免这样的情况出现。 Primer Premier 5.0 的使用技巧简介 一、功能 “Premier”的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计( )、限制性内切酶位点分析( )和DNA 基元(motif)查找( )。“Premier”还具有同源性分析功能( )，但并非其特长，在此略过。此外，该软件还有一些特殊功能，其中最重要的是设计简并引物，另外还有序列“朗读”、DNA 与蛋白序列的互换( )、语音提示键盘输入( )等等。 有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA 来设计引物，由于大多数氨基酸(20 种常见结构氨基酸中的18 种)的遗传MM不只一种，因此，由氨基酸序列反推DNA 序列时，会遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。遗传MM规则因物种或细胞亚结构的不同而异，比如在线粒体内的遗传MM与细胞核是不一样的。“Premier”可以针对模板DNA 的来源以相应的遗传MM规则转换DNA 和氨基酸序列。软件共给出八种生物亚结构的不同遗传MM规则供用户选择，有纤毛虫大核(Ciliate Macronuclear)、无脊椎动物线粒体(Invertebrate Mitochondrion)、支原体(Mycoplasma)、植物线粒体(Plant Mitochondrion)、原生动物线粒体(Protozoan itochondrion)、一般 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 (Standard)、脊椎动物线粒体(Vertebrate Mitochondrion)和酵母线粒体(Yeast Mitochondrion)。 二、使用步骤及技巧 其主要功能在主界面上一目了然(按钮功能如上述)。限制性酶切点分析及基元查找功能比较简单，点击该功能按钮后，选择相应的限制性内切酶或基元(如-10 序列，-35 序列等)，按确定即可。常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。你还可以编辑或者添加新限制性内切酶或基元。 进行引物设计时，点击按钮，进一步点击按钮，出现“search criteria”窗口，有多种参数可以调整。搜索目的(Seach For)有三种选项，PCR 引物(PCR Primers)，测序引物(Sequencing Primers)，杂交探针(Hybridization Probes)。搜索类型(Search Type)可选择分别或同时查找上、下游引物(Sense/Anti-sense Primer，或Both)，或者成对查找(Pairs)，或者分别以适合上、下游引物为主(Compatible with Sense/Anti-sense Primer)。另外还可改变选择区域(Search Ranges)，引物长度(Primer Length)，选择方式(Search Mode)，参数选择(Search Parameters) 等等。使用者可根据自己的需要设定各项参数。如果没有特殊要求，建议使用默认设置。然后按，随之出现的Search Progress 窗口中显示Search Completed 时，再按，这时搜索结果以 表格 关于规范使用各类表格的通知入职表格免费下载关于主播时间做一个表格详细英语字母大小写表格下载简历表格模板下载 的形式出现，有三种显示方式，上游引物(Sense)，下游引物(Anti-sense)，成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式，并按优劣次序(Rating)排列，满分为100，即各指标基本都能达标。 点击其中一对引物，如第1#引物，并把上述窗口挪开或退出，显示“Peimer Premier” 主窗口。该图分三部分，最上面是图示PCR 模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构(Hairpin)，二聚体(Dimer)，错误引发情况(False Priming)，及上下游引物之间二聚体形成情况(Cross Dimer)。当所分析的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由变成，点击该按钮，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有，只有。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度，可参考应用。 在需要对引物进行修饰编辑时，如在5’端加入酶切位点，可点击，然后修改引物序列。若要回到搜索结果中，则点击按钮。 如果要设计简并引物，只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传MM规则，反推至DNA 序列即可。对简并引物的分析不需像一般引物那样严格。 总之，“Premier”有优秀的引物自动搜索功能，同时可进行部分指标的分析，而且容易使用，是一个相当不错的软件。 Oligo 6.22 使用技巧简介 一、功能 在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。Oligo 5.0 的初始界面是两个图:Tm 图和ΔG 图;Oligo 6.22 的界面更复杂，出现三个图，加了个Frq 图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。 二、使用(以Oligo 6.22 为例) Oligo 6.22 的启动界面中显示的三个指标分别为Tm、ΔG 和Frq，其中Frq 是6.22 版本的新功能，为邻近6至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade 排列方式不太方便，可从windows 菜单改为tili 方式。如果觉得太拥挤，可去掉一个指标，如Frq，这样界面的结构同于Oligo 5.0，只是显示更清楚了。 在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击Tm 图块上左下角的Upper 按钮，选好上游引物，此时该按钮变成，表示上游引物已选取好。下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成Lower.?G 值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的?G 值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低。 Tm 值曲线以选取72?附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq 曲线为“Oligo 6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用3’端Frq 值相对较低的片段。 当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成(cross dimer)。二聚体形成的能值越高，越不符合要求。一般的检测(非克隆)性PCR，对引物位置、产物大小要求较低，因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构(hairpin);与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5 为好。 当然，在设计克隆目的的PCR 引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低。这种PCR 需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC 含量，以45-55,为宜。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，导致引物的GC 含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近，以有利于退火温度的选择。如果PCR 的模板不是基因组DNA，而是一个特定模板序列，那么最好还进行False priming site 的检测。这项检查可以看出引物在非目的位点引发PCR 反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比较高，就可能出假阳性的PCR 结果。一般在错配引发效率以不超过100 为好，但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正 确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为450 以上，而在错误位点的引发效率为130，那么这对引物也是可以接受的。 当我们结束以上四项检测，按Alt+P 键弹出PCR 窗口，其中总结性地显示该引物的位置、产物大小、Tm 值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。 由于“Oligo”软件的引物自动搜索功能与“Primer Premier 5”的相类似，并且似乎并不比后者更好用，在此不再赘述。其实，使用软件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求去寻找最佳引物，如果参数设置得当将大大提高工作效率。 除了本地引物设计软件之外，现在还有一些网上引物设计软件，如由Whitehead Institute开发的“Primer 3”等。该软件的独特之处在于，对全基因组PCR 的引物设计;可以将设计好的引物对后台核酸数据库进行比对，发现并排除可引发错配的引物。因此建议经常做全基因组PCR 的用户试用。