蛋白FITC标记及葡聚糖凝胶柱使用

      蛋白FITC标记及葡聚糖凝胶柱使用 荧光素FITC标记抗体 纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。有两种异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下: FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质 → FITC-NS-C-N-H2-蛋白质 FITC 是在荧光素的基础上通过化学反应增加硫氰酸基团得到的，硫氰酸基团可以和生物活性物质例如蛋白质上的伯胺基团反应形成硫脲键，从而实现对生物活性物质的荧光标记 步骤： (1)试剂和材料 ①0．01mol／L(pH7．2)PBS配法中，校定pH至7．2。NaCI18g、Na2HP04 1．15g，溶于2000ml蒸馏水 ②0．1mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液配法 取0．5mol／LNa2CO3(5．3％)10ml加入0．5mol／LNaHC03(4．2％)90ml，混合后，校定pH至9．0。 ③3％碳酸钠水溶液配法 称5g无水碳酸钠充分溶解于50ml灭菌蒸馏水中即成。 ④其他试剂和材料 l％叠氮化钠、离心机及离心管、烧杯(25m1)、搅拌器、无菌吸管及毛细滴管、烧杯(500m1)透析袋等。 (2)方法及步骤 ①取高效价的抗人球蛋白兔免疫血清，分离球蛋白，用盐水(0．15mol／LNaCl)及缓冲液(0．5mol／LNaHC03—Na2C03，pH9．0)稀释使每毫升内含蛋白质1-5mg，缓冲液为总量的10％，降温至4℃。 ②加入异硫氰酸盐(FITC)荧光素[蛋白：荧光素＝(50—80)mg‘lmg]，在0～4℃下电磁搅拌12～14h。 ③然后用半饱和的硫酸铵将标记球蛋白沉淀分离，除去未结合的荧光素，再用缓冲盐水透析，除去硫酸铵(用Nessler试剂测验，至隔夜透析的盐水无氨离子及荧光色素为止)。 ④将制备好的荧光抗体加叠氮化钠0.01％，分装在lml安瓿中，或冻干，保存于冰箱中(4℃)可以用半年以上，-20℃保存可达2年以上。 4．透析标记法 此法适用于小量抗体的荧光素标记，标记简便，非特异性染色较少。 (1)试剂和材料 试剂和材料同改良法。 (2)方法及步骤 ①用0．025mol／L碳酸盐缓冲液pH9．0，将欲标记免疫球蛋白稀释成1％浓度，装入透析袋中。 ②用同一缓冲液将FITC配成0．1mg／ml的溶液，按10mg／ml球蛋白溶液体积的10倍，将FITC稀释液盛于圆柱形容器内，并使透析袋浸没于FITC液中。 ③容器顶端盖紧，底部放搅拌棒，在4~C电磁搅拌下透析标记24h。取出透析袋中标记液，即刻用SephadexG50凝胶过滤，去除游离荧光素，分装，贮存于4℃中。 FITC CAS#：3326-32-7 中文名：异硫氰酸荧光素 英文名：Flourescein iso-thiocyanate；FITC     结构式： 分子式：C21H11NO5S 分子量：389.38 性质： 1. 外观：黄色粉末 2. 纯度：≥95% (HPLC) 3. 产品描述： FITC能和各种抗体蛋白结合，结合后的抗体不丧失与一定抗原结合的特异性，并在碱性溶液中具有强烈的黄绿色荧光。通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。最大吸收光波长为490～495nm，（黄绿光范围）最大发射光波长为525～530nm.（黄光范围） 4. FITC标记抗体流程： （1）将待交联的蛋白（浓度≥2mg/mL）对交联反应液透析三次4 ℃，至pH＝9.0。交联反应液配制方法：7.56g NaHCO3，1.06g Na2CO3，7.36gNaCl，加水定容至1L。 （2）将FITC溶于DMSO中，浓度为1mg/mL。每次交联使用的FITC均应新鲜配制，避光。 （3）按P:F（蛋白质:FITC）=1mg:50μg 的比例将FITC缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，暗处4 ℃反应8 h。 （4）加入5mol/L的NH4Cl至终浓度50mmol/L（稀释100倍），4℃终止反应2 h。 （5）将交联物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮。 （6）交联物的鉴定 蛋白浓度(mg/mL) = [ A280– 0.31×A495 ] / 1.4 F/P比例: 3.1×A495 / [A280 – 0.31×A495 ]，该值应介于2.5 ~ 6.5之间。 （7） FITC交联的蛋白应置于pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，加入0.1% NaN3、1% BSA，4℃避光保存。 储存条件：4℃避光保存 实验要点及说明： 偶联反应要求在尽可能接近pH9.8的溶液中进行，而且注意在反应过程中要保持此pH水平；； FITC与蛋白质的比值（F/P）,可通过测定495nm与280nm吸光度来鉴定。此比值的范围应为0.3－1.0； FITC唯一的缺限是易被光淬灭，因此复合物必须始终避光保存； 如果FITC－复合物对PBS透析不充分，可能造成高本底，对免疫荧光染色产生干扰。 1. Prepare a solution of at least 2 mg/ml of protein in 0.1 M sodium carbonate buffer, pH 9. Notes: Do not store sodium carbonate-bicarbonate buffer more than 1 week at 0-5 °C. The pH of the buffer may change upon storage. It is advised that fresh buffer be made just before use.The protein to be conjugated should be free of contaminating proteins, and protein solutionsshould not be prepared in buffers containing sodium azide or amines such as Tris or glycinesince they inhibit the labeling reaction. If the buffer contains amines or sodium azide, dialyze protein solution against PBS, pH 7.4, overnight at 0 - 5 °C. Avoid dialysis at high pH values (> 8.0-8.5) as this may be harmful to some proteins. 要确定在偶联反应缓冲液中不含游离氨基（Tris,氨及叠氮钠均可与FITC反应，因此会降低蛋白质与FITC的偶联率） 2. Dissolve the FITC in anhydrous DMSO at 1 mg/ml. 将FITC溶于DMSO中，浓度为1mg/mL。每次交联使用的FITC均应新鲜配制，避光。 Note: This should be prepared fresh for each labeling reaction. 3. For each 1 ml of protein solution, add 50μl of FITC solution, very slowly in 5 ml aliquots while gently and continuously stirring the protein solution. 按P:F（蛋白质:FITC）=1mg:50μg 的比例将FITC缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，暗处4 ℃反应8 h。 4. After all the required amount of FITC solution has been added, incubate the reaction in the dark for 8 hours at 4 °C. 5. Add NH4Cl to a final concentration of 50 mM and incubate for 2 hours at 4 °C. 加入5mol/L的NH4Cl至终浓度50mmol/L， 4 ℃终止反应2 h。 6. Add xylene cyanol to 0.1% and glycerol to 5%. 7. Separate the unbound FITC from the conjugate by gel filtration using a fine-sized gel matrix with an exclusion limit of 20,000 to 50,000 (for globular proteins such as antibodies). With the column flow stopped, carefully layer the reaction mixture onto the top of the column. Then open the column, allowing the reaction mixture to flow into the column. Just as it all enters the column bed, carefully add PBS to the top of the column and connect to a buffer supply. Two bands will form on the column. The faster moving band, which is the conjugated protein, elutes first and can usually be seen under room light. The slower moving band is the unreacted (free) FITC and xylene cyanol and will elute only with subsequent PBS washes. 8. Store the conjugate at 4 °C in the column buffer in a light-proof container. Sodium azide may be added as a preservative (final concentration 15 mM). If the protein concentration is low (< 1 mg/ml), bovine serum albumin (BSA) may be added to a final concentration of 1%. 9. The ratio of fluorescein to protein of the product can be estimated by measuring the absorbance at 495 nm and 280 nm. The F/P ratio should be between 0.3 and 1.0. Lower ratios will yield low signals; higher ratios will give high background. 葡聚糖凝胶柱的使用方法 (1) 预处理 称取Sephadex G-25（50－100目）约5（1）g，加入蒸馏水100ml，置室温下3h(过夜)进行溶胀。（将溶胀时漂在表面的颗粒去掉） (2) 装柱 凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧，用洗净的玻璃丝（约200目尼龙布）垫底或购买类似规格的商品柱。然后将柱垂直安装好，先加入1/3柱体积蒸馏水，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入，使它们在柱内自然沉降。同时大开下口慢速流出蒸馏水。装柱后的凝胶必须均匀，不能有气泡或明显条纹。否则，必须倒出重装，装好后，用蒸馏水平衡2－3h即可加样品分离。 (3) 加样 加样前，首先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出，直到柱内液面与凝胶表面相齐（或留一极薄液层）为止。然后，由柱的上端加水解液2ml，注意不要让溶液把凝胶冲松浮起，加完样品后，打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐，再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器2－3次，待全部进入层析柱后，即可进行洗脱。 (4) 洗脱与收集 洗脱时，用蒸馏水作洗脱剂，并且要连续不断地进行，使凝胶柱上端保持一定的液层，防止凝胶柱表面的液体流干。本实验洗脱液流出的速度应控制在0.8－1.0ml/min。洗脱液的收集采用分管连续顺序收集，每管收集3ml，共收集10管。 (5) 凝胶的再生和回收 凝胶柱使用一次后，必须反冲疏松一次，平衡后再使用。若使用数次，就需要再生处理。用0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液浸泡，然后用蒸馏水洗至中性备用。若实验完毕，将再生后的凝胶在布氏漏斗上用蒸馏水洗涤抽干，再用95%乙醇洗两次，在60℃烘箱中烘干，回收保存。