从菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白酶研究（可编辑）

从菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白酶研究（可编辑） 广西大学 硕士学位论文 从菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白酶的研究 姓名易元龙 申请学位级别硕士 专业化学工艺 指导教师廖安平廖丹葵 20090531从菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白酶的研究 摘要 本文主要研究了以菠萝加工废弃物菠萝皮为主要原料分离提取菠萝 蛋白酶的工艺 采用法检测浸提液中菠萝蛋白酶活性实验结果表明法检测浸 提液中菠萝蛋白酶酶活是可行的加标回收率在之间 为了防止菠萝蛋白酶生产过程中失活以菠萝皮和茎的提取液为对象 研究了温度及停留时间值金属离子种类和浓度多元醇和糖等因素 对浸提液中菠萝蛋白酶活性的影响在实验范围内温度超过?时菠萝 皮和茎的浸取液中菠萝蛋白酶将明显失活在浸提液原始生理条 件 下浸提液中菠萝蛋白酶稳定性最好等金属离子都使菠 萝皮浸提液中菠萝蛋白酶稳定性下降的影响最大含量在 一 时可提高菠萝皮浸提液中菠萝蛋白酶的稳定性甘油 和葡萄糖可明显提高菠萝皮浸提液中菠萝蛋白酶的稳定性 研究了用硫酸铵从菠萝皮浸提液中析出菠萝蛋白酶的影响因素不同 值下盐浓度对菠萝皮浸提液中菠萝蛋白酶酶活沉降率的影响的研究得 盐浓度为 出酶活沉降率在 时达到最大值对不同盐浓 度下菠萝蛋白酶单位酶活变化对酶活沉降率的影响的研究表明随菠萝蛋 白酶单位酶活的增加酶活沉降率先增大后减小在单位酶活达 大时酶活沉降率达到最大值在单位酶活较小时盐浓度为的酶活沉降率大于盐浓度为 时的酶活沉降率在单位酶活 大于或等于 时盐浓度为 的酶活沉降率大于 时的酶活沉降率盐浓度对纯化倍数影响的研究得出随盐浓度 的增大纯化倍数呈下降趋势在盐浓度为 时纯化倍数为 在至 趋于稳定为左右以后趋于递减 研究了操作条件对菠萝皮浸提液中菠萝蛋白酶超滤过程中酶活 截留 率渗透通量和浓缩倍数的影响不同膜切割分子量下压力对渗透 通量影 响不同膜切割分子量 在压力 时渗透通量达到最大 和 时渗透 值分别为 一 时在压力 通量达到最大值为值对菠萝蛋白酶酶活截留率及渗透通量 时渗透通量最高且为 用 的膜超滤 有影响在 后酶活截留率呈一定速率下降超滤浓缩倍数在至之间较好 从菠萝皮浸提液中超滤浓缩菠萝蛋白酶的最佳工艺操作条件为 膜切割分 子量 压力为浓缩倍数在至之间 由整个工艺流程提取出酶活性达 的菠萝蛋白酶酶的提 取回收率达以湿皮重计超滤盐析法具有操作简单对环境 污染小酶活较高酶的提取沉降率高 关键词菠萝蛋白酶稳定性超滤提取菠萝皮 ?町 ? 一 符号说明 单位或量纲 褂口丐 意义 法测定的酶试样单位酶活 一 胁 蛳 每 所用酶试液中含酶试样的质量 处酶试样的的吸光度 锄 酶活回收率 沉析后固体粗酶总质量 矿 菠萝蛋白酶皮汁初始总体积 一 原液的单位酶活 易 盐析后固体粗酶中单位酶活 一 乓艿 酶活截留率 截留液中菠萝蛋白酶总酶活 坼 原料液中菠萝蛋白酶总酶活 截留液中单位酶活 日 截留液体积 场 原料液体积 渗透液体积 所 渗透时间 超滤有效面积 体积浓缩倍数 渗透液体积 浓缩倍数 一 渗透通量 ‰巧以舭 膜切割分子量 广西大学学位论文原创性声明和学位论文使用授权说明 学位论文原创性声明 本人声明所呈交的学位论文是在导师指导下完成的研究工作所 取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有除已注明部分外论文中不包含其它 人已经发表过的研究 成果也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容对本文的研 究工作提供过重要帮 助的个人和集体均已在论文中明确说明并致谢 论文作者签名 多月步日 力辟 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集保存使用学位论文的规定即 本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版并提供目录检索与阅览服务 学校可以采用影印缩印数字化或其它复制手段保存论文 在不以赢利为目的的前提下学校可以公布论文的部分或全部内容 请选择发布时间 图实时发布 解密后发布 保密论文需注明并在解密后遵守此规定 论文作者签名髟 新獬栌嘶拍从萝菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白酶的研究 广西大学硕士学位论文 第一章绪论 课题背景 菠萝 又名风梨属草本植物是热带著名的水果在我国主要 分布于广东广西福建台湾等地菠萝是我国南方栽培面积最广产量较大的大众 水果之一菠萝营养丰富富含糖类果糖葡萄糖等蛋白质氨基酸有机酸维 生素矿物质等其蛋白质中含有分解蛋白质的酶称为菠萝蛋白酶 菠萝蛋白酶 是从凤梨科植物组织中制取分离出的蛋白水解酶组合物的总称根据分离 提取部位的不同分为果菠萝蛋白酶和茎菠萝蛋白酶 年等首先用硫酸铵沉淀法从菠萝果实中分 离出了果菠萝蛋白酶年等人从菠萝茎中制取蛋白水解酶从此菠萝蛋 白酶实现了商品化生产菠萝蛋白酶存在于菠萝植株茎叶果实果柄果皮果芯 等部位中菠萝植物中的茎果实果皮的菠萝蛋白酶含量相对较高而果柄果芯和 叶中的菠萝蛋白酶含量相对较少菠萝蛋白酶富有菠萝香气浅黄色至棕黄色粉末 含有丰富的半胱氨酸 菠萝是世界水果中的第六大品种世界上最重要的菠萝产地在泰国中国菲律宾 印度尼西亚墨西哥夏威夷巴西和南非等国家和地区据不完全统计菠萝的世界 总产量早在年代就超过千万吨在近千万吨菠萝中以鲜果供应市场的约占六成加 工产品约占四成我国菠萝资源丰富年产菠萝万吨以上约有万吨 菠萝皮和 万吨菠萝茎被费弃造成了浪费和环境污染进入年代以来随着国内果汁工业的兴 起和发展在年间南方菠萝产区已耗资数亿元引进了浓缩菠萝汁生产线近条 加工菠萝能力在万吨年之间水果加工过程中大量废弃的菠萝皮等下脚料一般 要占投料的以往均作为废弃物丢掉只有少部分用作饲料从菠萝植株中提 取菠萝蛋白酶的原料有两类一是菠萝茎果实二是菠萝加工的废弃物果皮和果芯 两者都可以用于生产菠萝蛋白酶酶产品的组成稍有不同其功能相似茎中的酶含量 和活力较高最有开发利用价值但原料的获取受到限制菠萝加工的废弃物果皮和果 芯中的菠萝蛋白酶含量也较高也是一种较理想的生产菠萝蛋白酶的原料因而利用 菠萝加工下脚料提取菠萝蛋白酶不仅可充分利用资源还可减少菠萝加工企业废弃物广西大学硕士学位论文 从萝菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白酶的研究 对环境的污染 印度和泰国由于地理优势盛产优质菠萝他们的蛋白酶产量大品 质好而且产品开发的历史较长具有品牌效应是我国强劲的竞争对手泰国的 年产菠萝蛋白酶吨左右是世界上最大的生产厂其产品据称在世界市 场份额占有率高达泰国产的菠萝酶多采用盐析法产品含有硫酸铵成分国内只 有几个小厂生产广西区内还没有生产厂加强对菠萝蛋白酶分离提取和菠萝蛋白酶开 发利用的研究开辟菠萝深加工增值和废弃物综合利用的新途径无论对于菠萝产业的 发展还是对于资源的再利用都有很重要的意义将产生广泛的经济与社会效益 菠萝蛋白酶的性质 菠萝蛋白酶组成成分及理化性质研究 菠萝蛋白酶商品为浅棕黄粉末有特定菠萝香味人们对菠萝蛋白酶进行了一系列 研究发现这些蛋白酶不是单一的成分而是由多种不同分子量和分子结构的酶组成 茎中至少存在三种蛋白水解酶 和茎酶的分子量为 也含有非蛋白水解酶包括一种酸 性磷酸酶及过氧化酶也可能含有淀粉酶及纤维素酶活性还存在其他成分已知的菠 萝蛋白酶及木瓜酶的蛋白水解酶在活性中心区域的氨基酸序列有很高的同一性此结果 表明菠萝蛋白酶和木瓜酶使用相同的催化机理但是菠萝蛋白酶与木瓜蛋白酶具有不 同的裂解特异性等人从菠萝果中分离出主要的生物蛋白分子量为 是一种酸性蛋白等电点为等人认为菠萝蛋白酶至少存在两个组分 分别为和都具有蛋白水解活性的分子量约为 分子量 为 的等电点在与之间等电点为与具有 同样的末端氨基酸系列 个残基果菠萝蛋白酶茎菠萝蛋白酶和菠萝果上的主 要酸性蛋白也具有同样的一末端氨基酸系列个残基与都具有高的糖 基组分的蛋白水解活性是的两倍菠萝蛋白酶是一种糖蛋白分子结构中 含有一个寡糖分子由木糖岩藻糖甘露糖 和一乙酰葡萄胺组成共价连接在肽链上 和等人分别推测出了糖分子的结构与是两个单酶两者的催化性 质无关等研究表明菠萝蛋白酶分子结构中糖分子不是催化必需的基团 巯基基团是菠萝蛋白酶分子催化水解活性基团等菠萝蛋白酶进 行研究表明 广西大学硕士学位论文 从萝菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白酶的研究 菠萝蛋白酶相对分子量为 等电点为分子中有个一乙酰化的氨基己糖 含糖分子中有个氨基酸残基含氮量为等排列出了菠萝 蛋白酶主要组分的氨基酸顺序有种氨基酸共个端的氨基酸为谷氨酸 陈清西等研究认为羧基 端的氨基酸为丙氨酸相对分子质量为 和羟基与酶活性无关而氨基巯基色氨酸残基和组氨酸残基是酶催化活性的必需基 团菠萝蛋白酶成分的复杂性限制了其在生产中的应用特别是医药领域对功能成分 的要求上因此对菠萝蛋白酶的成分和各成分的具体功能的分析研究具有重要意义 菠萝蛋白酶酶学特征研究 菠萝蛋白酶是一种蛋白质水解酶菠萝蛋白酶的催化活性具有高效性专一性温 和性及酶的活性可调节控制性菠萝蛋白酶有显著的热稳定性能在至?保持蛋白 水解活性而其它大部分酶被破坏变性菠萝蛋白酶最佳的蛋白水 解温度范围在至 ?之间温度越高酶的热失活增强反应速度下降菠萝蛋白酶比其它大部分酶在 酸性 不同酸度条件下有更大的有效活性范围其在在之间能保持稳定 环境中酶反应速度下降快在碱性下有个较宽的应用范围酶较稳定的范围在 菠萝蛋白酶水解活性在附近达最大值菠萝蛋白酶易受到铜铁等金属 离子的影响使活性降低而对酶反应影响不大对酶有一定 程度的抑制作用菠萝蛋白酶也是一类巯基蛋白酶其活性中心为巯基它的 水解蛋白活性较木瓜酶高倍以上酶液的最大吸收波长为 浓度的酶液 在 的光吸收值达等人 用共振光散射光谱仪研究菠萝蛋白酶和用硫基 和羧基修饰的纳米粒子之间的相互作用由于该纳米粒子是水溶性且具有生物兼容 性并在碱性溶液里稳定且带有负电当溶液值低于菠萝蛋白酶等电点时氨基离子带 范围 有正电因此它们之间发生静电作用而能用该装置检测 里的菠萝蛋白酶浓度 菠萝蛋白酶的应用 菠萝蛋白酶在药物食品等方面应用 菠萝蛋白酶中含有多种不同蛋白水解酶组分多种蛋白质及多肽具有催化水解活 性医学上认为菠萝蛋白酶是一种具有消炎及抗水肿作用的疏基酶临床上可用作抗水 肿和消炎药口服后能加强体内纤维蛋白的水解作用将阻塞于组织的纤维蛋白及血凝 广西大学硕士学位论文 从萝菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白酶的研究 块溶解改善体液的局部循环从而消除炎症和水肿菠萝蛋白酶与抗生素及化疗药物 并用能促进药物对病灶的渗透和扩散它的优点是能分解纤维蛋白的大分子但不破 坏凝血所必需的纤维蛋白原可用于缓解心绞痛和中风治疗也可用于各种炎症水肿 血肿及血栓如支气管哮喘支气管炎急性肺炎产后乳房充血乳腺炎及视网膜炎 等与抗菌药物并用对治疗关节炎关节周围炎及小腿溃疡等均有效并能治疗腹泻 菠萝蛋白酶用于烧伤脱痂能选择性地除去死皮对正常皮肤无不 良影响脱痂彻底 对治疗烧伤有重要意义菠萝蛋白酶能够抑制肿瘤细胞的生长降低毒素结合活性并 能抑制热不稳定毒素及霍乱毒素的分泌效应菠萝蛋白酶能增进药物的吸收与各种 抗生素联用能提高其疗效并能促进营养物质的吸收菠萝蛋白酶具有免疫刺激作用 体内外研究表明通过对辅助细胞的刺激作用和对细胞的直接抑制反应菠萝蛋白酶 可以增强和抑细胞的免疫反应 目前菠萝蛋白酶制品大多数是各种成分的混合 物其组成因不同的品种产地及提取方法等而产生一定的差异因此有必要进一步 确定真正起作用的具体成分研究更适当的提取工艺得到专一性更强的药物 菠萝蛋白酶在食品工业中作为一种添加剂能分解蛋白质肽酯和酰胺等可使 肉质嫩化啤酒澄清提高啤酒的非生物稳定性及冷贮稳定性添加展可有明显效 果特别是在水解蛋白制备营养口服液上有着良好的应用前景 菠萝蛋白酶对含酪氨 酸较多的蛋白质有很强的水解能力用于牛肉加工中的嫩化过程 可缩短时间提高牛 肉的适口感在生物化学工业生产上用于干酪明胶水解蛋白的生产 菠萝酶市场现状和前景 随着从们对菠萝蛋白酶用途不断的开发国内外对菠萝蛋白酶的需求量逐年增多 特别是精制的菠萝蛋白酶在医药领域对菠萝蛋白酶的纯度要求越来越高甚至要 明确起功能作用的具体成分精制菠萝蛋白酶目前的市场价约为元千克一我 大多数产品是以粗酶形式 国菠萝蛋白酶的研究和生产起步较晚国内年产量不足 出售产品的附加值低据悉我国年需菠萝蛋白酶千吨以上而国内生产量不足 市场前景广阔? 菠萝蛋白酶分离提取及稳定性研究进展 菠萝蛋白酶分离提取研究 三种常用的菠萝蛋白酶提取工艺 酶的分离提取一直沿用离子交换吸附冷丙酮酒精无机盐沉淀等方法国内外 广西大学硕士学位论文 从萝菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白酶的研究 很早就对菠萝蛋白酶进行研究从发展过程来看菠萝蛋白酶的提取方法有高岭土吸附 法单宁沉淀法和超滤有机溶剂提取法各种方法比较为 高岭土吸附法 压榨 高岭土吸附 菠萝下脚科汁液?吸附物 离心 洗脱液压滤 盐析 洗脱液?盐析物?湿粗酶饼 干燥 溶解过滤 沉淀 澄清液湿酶精品 图卜高岭土吸附生产工艺流程图 高岭土吸附生产工艺流程图如图一所示操作要点?压榨将菠萝下脚料洗净 用压榨机压出汁液加入苯甲酸钠防腐迅速过滤除杂质?吸附将汁液移入 吸附槽中搅拌同时加入的高岭土搅拌约 在?吸附 用虹吸 排掉上清液收集高岭土吸附物?洗脱用的溶液调节吸附物的值至 左右再加入吸附质量为的工业食盐搅拌 进行洗脱然后迅速压滤 收集滤液?盐析将压滤液收集在盐析槽中用的盐酸调节值至左右 搅拌加入压滤液质量的硫酸铵待完全溶解后?过夜然后离心收集沉淀盐 析物即粗酶?溶解将粗酶放入溶解罐中加入倍水用溶液调值 至搅拌使其溶解过滤除杂收集滤液?沉淀干燥在搅拌下用的 使酶析出用离心机分离出沉淀物冷冻真空 盐酸调节上述滤液的值至静置 干燥或减压干燥即得菠萝蛋白酶精品 高岭土吸附法生产工艺和操作都比较复杂吸附剂用量较大约原料消耗多 所需设备也多酶活总回收率低小于但产品质量好纯度高由于使用高岭 土并使用盐析工艺对环境造成污染环保投资较大 单宁沉淀法 广西大学硕士学位论文 从萝菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白酶的研究 压榨 去杂质 菠萝下脚科斗汁液?澄清液 加稳定齐 加单宁 洗脱 稳定液单宁沉淀物 干燥 滤液?酶制品 图卜单宁沉淀法生产工艺流程图 单宁沉淀法生产工艺流程图操作要点?压榨方法同前?去杂质鲜菠 萝汁经过滤去杂?加稳定剂将澄清液移入生产罐中在搅拌条件下加入澄清液体 积的的二氧化硫的维生素?加单宁立入 的单宁在?下静置 离心弃去上清液收集沉淀物?洗脱干燥将沉 淀物放入溶解罐中倍值为的抗坏血酸溶液或用的盐酸调 值到搅拌洗脱 然后过滤收集滤液减压干燥或冷冻真空干燥即得菠萝蛋 白酶精品 单宁沉淀法工艺各操作比高岭土工艺简单原料消耗少所需设备少易于土法上 马但酶回收率低部分产品能达到食品级由于生产中加入单宁对环境污染大 超滤有机溶剂浓缩法菠萝下脚料汁液澄清液浓缩液加有机沉淀剂 沉淀出的粗酶减压干燥获得产品此法利用膜分子截留原理将小于蛋白酶分子的大部 分物质过滤除去以达到浓缩酶液的目的经超滤浓缩后的酶浓缩 液加入有机溶剂将 酶析出低温干燥得到酶制品这种方法较前两种方法操作步骤少条件温和降低了 酶活损失生产和环保投入少但所得酶制品中含有没有酶活性的杂蛋白较多低温操 作 广西大学硕士学位论文 从萝菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白酶的研究 压榨 去杂质 菠萝下脚料?汁液?澄液液 超滤浓缩 降温 浓缩液 ?加有机溶剂 沉淀 干燥 湿酶?酶制品 图卜超滤法浓缩提取工艺流程图 超滤法浓缩提取工艺流程图如图所示操作要点?压榨方法同前?去杂 质可用压滤法或离心法去杂质?超滤浓缩将澄清液在管式超滤设备中进行浓缩 使体积浓缩至原体积的?有机溶剂沉淀将浓缩液降温至?边搅拌边加入 ?的乙醇直至混合液中乙醇浓度为静置使酶沉淀移出上清液即得湿 酶?干燥将湿酶在?下减压干燥或冷冻真空干燥即得菠萝蛋白酶精品 高岭土吸附法和单宁吸附法均为传统的菠萝蛋白酶提取方法提取的过程中均需要 加入化学物质将酶与非酶物质分开从而达到分离纯化酶的目的由于提取过程中化学 物质的加入以后难以完全分离会影响产品的质量从而也限制了产品的应用范围超 滤有机溶剂浓缩法工艺需要在低温条件下进行沉析操作成本较高 其它相关菠萝蛋白酶提取技术研究 中国专利菠萝蛋白酶的新提取方法提供了菠萝加工下脚料提取菠萝蛋白酶的新 方法用一种高分子化合物聚丙烯酸作为沉淀剂将果汁中的菠萝蛋白酶沉淀然后沉淀 用水悬浮调节值解析用将聚丙烯酸除去盐析后得到酶成品整个生产工艺 操作较为复杂形成规模生产控制难度大中国专利菠萝蛋白酶冷冻干燥粉的制备方法 提供了一种菠萝蛋白酶冷冻干燥分离的制备方法菠萝茎压榨取 汁后用氧化锌吸附 解析后进行超滤浓缩浓缩液冷冻干燥得成品该方法在酶浓缩提取的过程中的温度均 高于?根据工厂生产经验菠萝酶料液易发酸变质酶活力损失也很大产品质量 难以保证而且吸附与解析操作过程繁琐无法形成连续操作难以进行产业化提取生 产中国专利一种菠萝蛋白酶的制造方法采有菠萝茎为原料采用冷却水循环降温逐 级离心分离超滤膜浓缩来分离提取菠萝蛋白酶其设备投资大能耗高酶活较低且 不能对除菠萝茎以外的其它菠萝废弃物有效利用 广西大学硕士学位论文 从萝菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白酶的研究 在寻求新型吸附剂吸附分离方面美国专利号叙述了使用特制的多孔二氧 化钛微球吸附剂用于菠萝果和茎的蛋白酶提取等人用离子交换色谱法分 离纯化菠萝蛋白酶纯度高适于小批量作业难以进行大规模生产等人用金 属螯合亲和膜提纯菠萝蛋白酶用活化的尼龙膜经羟乙基纤维素键合改性改性后的尼 龙膜与环氧氯丙烷氢氧化钠和硼氢化钠的混合溶液反应再将膜分别浸入碳酸钠硼 氢化钠和偶联剂的混合溶液和硫酸锌溶液得到螯合锌离子的金属亲和膜将上述金属 亲和膜上叠成膜堆放入膜桥蠕动泵送入缓冲液和洗脱液接着送入菠萝蛋 白酶溶液然后以洗脱剂进行洗脱得到菠萝蛋白酶等人使用反胶束萃取从 菠萝废弃物里分离纯化菠萝蛋白酶 中国专利菠萝蛋白酶成分通过快速蛋白液相层析使用装有诸如 的物质的柱子用乙酸缓冲液中的氯化钠线性梯度进行层析可以 得到好的菠萝蛋白酶蛋白的分离张桂香等用盐析法提取菠萝蛋白酶进行了研究李 兴等将黏土及活性炭混合经高温烧结制得可用于柱层析的 多孔陶瓷以陶瓷柱层析结合超滤法纯化果菠萝蛋白酶得到酶制品比活力 酶活力回收率为纯化倍数为这种吸附材料化学惰性好适用的范围宽可用 于柱层析实现连续吸附洗脱再生这一层析过程为工业化生产提供了可能性 掣利用磁性氧化铁微球固定聚丙烯酸吸附菠萝蛋白酶研究表明室温下介于 范围内菠萝蛋白酶的吸附率接近在以 叫的磷酸缓冲液和浓度 介于的作为洗脱液进行洗脱由于没有内扩散阻力吸附和解吸 过程在 内就能完成菠萝蛋白酶的酶活回收率为等人利用包 含环氧乙烷和环氧丙烷共聚物的双水相体系分离菠萝蛋白酶结果表明最佳分离条件 为共聚物中环氧乙烷含量共聚物的分子量 共聚物浓度为 温度? 盐溶液浓度在 时酶活回收率可达到黄惠华 等从茶叶中提取多酚类物质来分离菠萝蛋白酶酶的回收率达茶多酚不象单宁 那样带有毒性同时又避免了菠萝汁酸度和糖酸比的改变并使酶的稳定性有所提高 等报道了用配基沉淀并大规模分离菠萝蛋白酶的方法该配基有一个强的阴 离子磺酸盐它与带正电荷的蛋白质结合最初的结合使蛋白质结构变紧并从蛋白结 构中挤出水它的尾部是可堆放的疏水有机基团一含氮的芳香族染料使蛋白质一配基 复合物聚集在一起从稀释的原液中卜蛋白质形成稠密的沉淀可通过改变 使配基从共沉淀中释放出来也可用离子交换的方法将配基去掉 广西大学硕士学位论文 从萝菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白酶的研究 菠萝蛋白酶纯化技术研究 用于酶纯化的方法主要有层析和电泳等技术目前已得到部分层析纯和电泳纯的 单一菠萝蛋白酶组分并弄清了某些组分的理化性质及药理作用但由于纯化材料价格 昂贵等原因限这些材料在菠萝蛋白酶纯化的工业化应用等建立了一种 一柱层 分离纯化菠萝蛋白酶的方法先将菠萝蛋白酶溶解离心收集过 一层析得至至菠萝蛋白酶活性成分卜 析的活性成分再用 种组分年等用 通过 分别 阳离子交换柱分离出了茎菠萝蛋白酶中的主要两种结构成分 命名为和等用 阳离子交换柱和阴离子交 换柱分别从菠萝蛋白酶中分离出了种有活性的碱性酶和种酸性酶 迈诺特等圈将菠萝蛋白酶溶解于的乙酸缓冲液中通过在 上快速高效液相层析用 以上的溶于乙酸缓冲液中的氯化钠线 性梯度洗脱以分离菠萝蛋白酶的成分得到经测定的约 和 分子量并具有等电点和的蛋白并申请了专利报道了提 取纯化菠萝蛋白酶的方法通过硫酸铵分段沉淀获得部分纯化的菠萝蛋白酶粗酶在 醋酸钠缓冲液中透析然后通过一纤维素阳离子交换柱菠萝蛋白酶在 梯度下作为一个主峰被洗脱中国专利菠萝蛋白酶脱痂制剂及其 制备方法四精制菠萝蛋白酶采用一纤维素一进行离子交换柱层析再进行干燥以 获得更高纯度的精制酶菠萝蛋白酶是具有多种不同生理效应的混合物当菠萝蛋白酶 的某一个成分产生特定的效果时该混合物的某些其它成分有可能产生不利的副作用 这是菠萝蛋白酶混合物作为药物的主要弱点因此如果将具有特定生物活性的菠萝蛋 白酶的单组分分离出来并且单独施用以减少产生副作用的可能性这也菠萝蛋白酶分 离提纯技术发展的一个重要方向 本课题所用的分离技术简介 盐析法简介 盐析法是蛋白质传统的分离方法年首次使用硫酸镁成功地将血清 蛋白分成为清蛋白球蛋白两部分自那以后盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一 盐析法一般使用中性盐如硫酸铵过硫酸钠氯化钠和磷酸钠等其中运用最广的是 硫酸铵许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低若稍加一些无机盐则溶解度增加 这种现象称为盐溶 而当盐浓度继续增加到某一浓度时蛋白质又变 广西大学硕士学位论文 从萝菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白酶的研究 得不溶而自动析出这种现象称为盐析 这些现象的原理是由于蛋 白质是亲水胶体带有羧基解离的负电荷或氨基解离的正电荷其极性基团使分子间相 互排斥同时与水分子形成水膜这些因素保证蛋白质形成溶于水的溶胶状态当加入 少量盐时增多了蛋白质分子上的极性基团因而增大了蛋白质在水中溶解度出现盐 溶现象但当盐浓度增加到一定浓度时一方面大量的水同盐结合使得蛋白质没有 足够的水维持溶解状态破坏了维持蛋白质亲水胶的水膜容易沉淀出来另一方面加 入的盐离子中和了蛋白质分子所带电荷破坏了亲水胶体发生相互聚集而沉淀出来 这样就出现了盐析现象由于各种蛋白质盐析出来所需的盐浓度 也各异盐析 所需的最小盐量称做盐析浓度通过控制盐的浓度使蛋白质混合溶液中的各个成分分 步盐析出来获得分离目的蛋白质 硫酸铵具有多数其他盐所不具备的优点如在水中化学性质稳定溶解度大? 时能达到 的浓度溶解度的温度系数变化较小如?时饱和溶解度为 最 ?时饱和溶解度为 艮 而且硫酸铵 价廉易得分段效果比其他盐好性质温和即使浓度很高时也不会影响蛋白质的生物 学活性 盐析法应用于蛋白质酶的分离具有以下特点 ?成本低不需要特别昂贵的设备 ?操作简单安全 ?对许多生物活性物质具有稳定作用 超滤法简介 超滤膜分离是一种新兴的单元操作超滤膜分离过程已经在许多工业部门得到应 用例如饮料化学奶制品电子环境食品医药造纸石化石油制药 和纺织等工业与其它分离设备相比膜分离器更加紧凑较少投资与更加容易操作 控制和维护它的结构上通常是组件式的对于大规模的应用需要采用许多并联单元 这与更常用的分离操作相反它们是随装置规模变大而设计出更大的设备达到有效和 经济的超滤膜分离过程的关键是膜和它被组装成组件的形式膜应具有的特性是 好的渗透性高的选择性对过程环境的化学和机械适应性好的稳定性 不受污染和合理的使用寿命加工和组装的可控性承受膜两侧巨大压差的能 力 超滤是静压差推动力作用下进行的筛孔分离的过程主要依据溶质分子大小的拦截 广西大学硕士学位论文 从萝菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白酶的研究 作用实行分离超滤的超滤膜拦截亚微米级颗粒超滤拦截的溶质分子量典型的在 范围分子大小为 包括生物分子聚合物糖类和胶体粒子 超滤过程无相变能耗低设备简单占地少成为重要的工业单元操作技术能够连续 分离纯化缩短生产周期主要应用于食品和生物制品工业超滤分离技术可以用于浓 缩小分子溶质分离大分子溶质分级 在超滤过程中作为分离介质的是微孔膜超滤膜最常用的是非多孔性聚合物薄膜 但也可以是多孔性聚合物陶瓷或金属材料膜膜必须是不溶解和不破碎的典型的超 滤膜材料有醋酸纤维膜聚酰胺膜聚砜膜孔径为 超滤膜特性 用名义的分子量切割表示其定义是膜至少截留下至的最小球形溶 堇 质的分子量绝大部分工业用膜材料操作在 区域 菠萝蛋白酶稳定性研究 蛋白质酶失活机制研究 蛋白质的三维结构是由疏水相互作用静电相互作用氢键范德华力这些弱相互 作用力及二硫键所维持的它们的稳定自由能?曲一般低于 构象稳定性 很低在分离提纯过程中搅拌升温变化盐浓度变化添加表面活性剂或有机 溶剂等操作对大部分蛋白质都有造成结构变化的可能甚至蛋白质自身浓度的变化也有 可能造成三维结构的变化导致失活在分离提纯过程中酶发生失 活的机制有多种概 括起来有以下方面一方面是一级结构被破坏导致三维结构的变化肽键的酸水解和酶 水解在的梭基侧链上最迅速半胱氨酸色氨酸甲硫氨酸的氧化 二硫键被还原伴随一折叠消失和一巯基形成巯基与金属离子作用形成硫醇盐 和天冬酰胺和谷氨酰胺脱酰胺作用氨基酸的消旋作用脯氨酸的异构 化另一方面是三级或四级结构变化也可能导致失活聚集有时伴随分子和分子间二 硫键的形成巯基与金属离子作用形成硫醇盐酶失去辅酶寡聚蛋白质解离成单 体吸附于容器表面不正确的折叠形式或形成错配的二硫键从动力学上讲酶蛋白 在提纯过程中活性的丧失可能是由天然状态经过一系列相对稳定的中间态最终达到变 性状态一些酶蛋白处于中间状态时仍具有部分活性是一个可逆过程而成为变性态 则有的是可逆的有的是不可逆的 疏水相互作用对维持酶的天然结构起重要的作用而疏水性取决于蛋白质分子内部 疏水性氨基酸的个数因而具有更紧密的疏水核氢键和离子键对 酶蛋白的稳定性也有 作用氢键对小分子蛋白质具有与疏水作用相同的甚至更高的稳定作用许多研究者证 广西大学硕士学位论文 从萝菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白酶的研究 实酶复杂结构中具有许多的盐桥对一个球蛋白来说平均个氨基酸残基中只有一 个盐桥处于内部其它都在分子表面因此参与稳定酶的可能是处于分子表面的那些 离子键酶分子内二硫键数量的增加将提高酶的稳定性此外 和其他 一些离子对某些酶能起稳定作用这种稳定作用是通过阳离子与蛋白球体中不稳定部分 的结合而获得的特别是与多肽链弯曲处的结合使酶的总体结构更紧密结实短距离 范德华力对形成紧密堆积的核有很大贡献 菠萝蛋白酶稳定性影响研究 菠萝蛋白酶是一种蛋白质凡是能使蛋白质变性的因素都可能使酶失去活性如 物理因素时间温度压力光磁场化学因素氧化还原溶剂金属离子 离子强度和生物学因素酶修饰和酶降解即使酶在常温常压下也会逐渐失 去活力这是因为不管在任何温度下总会有少量酶分子处于较高能量状态这些分子 会越过能障成为非活性分子称为热失活菠萝蛋白酶是一种巯基蛋白酶对提纯后 的菠萝蛋白酶产品中菠萝蛋白酶的稳定性目前已有较多研究巯基蛋白酶的不稳定性 主要原因有两个一是其活性中心中的巯基状态由于氧化而改变当其中的变成 时酶便被钝化二是由于构象的改变而失活另外由于菠萝蛋白酶本来是在生 物细胞内合成并在细胞内行使功能的一旦提取出来用于细胞外的环境时再也没有细 胞内部的那种适宜环境其分子构象易发生改变因此人们生产的各种的生物酶制剂与 生物体内的酶相比其生物学活性和稳定性已大为下降所以菠萝蛋白酶在提取过程中 易失活极大地影响了其生产和应用 添加剂对菠萝蛋白酶稳定性的影响有较多的研究为了提高菠萝蛋白酶的稳定性 应尽量避开对其不利的环境在酶提取过程中添加的试剂包括金属鳌合剂抗氧化剂 以及疏水剂等对菠萝蛋白酶稳定性有影响的添加剂包括维生素 半胱氨酸苯甲酸 钠等维生素和半胱氨酸均可以作为稳定剂和抗氧化刹苯甲酸钠能有效地 抑制氧化脱氢酶从而减少氧化作用的发生提高酶活力作为金属鳌合剂能有 效地鳌合某些金属离子可避免因这些金属离子与酶结合而使酶失去活性一环糊精 可作为疏水剂活性保护剂组合有半胱氨酸与抗坏血酸硫代硫酸钠与半胱氨酸都能 提高菠萝蛋白酶活性使用还原性物质如抗坏血酸其分子上的活泼羟基氢可使酶活性 中心保持还原状态从而有效地保护酶活性半胱氨酸对菠萝蛋白酶有极显著的保护效 果林韶湘等在菠萝蛋白酶的提取过程中联合使用醋酸锌氯化钠抗坏血酸 使酶的收率得到提高用茶多酚沉淀菠萝蛋白酶使酶的稳定性有明显的提高这可能 广西大学硕士学位论文 从萝菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白酶的研究 与茶多酚的抗氧化特性及其对金属离子的鳌合作用有关茶多酚与菠萝蛋白酶结合后能 提高酶的热稳定性延长酶的半衰期 表面活性剂对菠萝蛋白酶稳定性的影响等人研究指出菠萝蛋白酶能抵抗 低浓度的表面活性剂粘合物而保持稳定是由于具有丰富的一折迭结构和紧凑坚硬 的球形构造结构使菠萝蛋白酶活性稳定 菠萝蛋白酶的固定化对菠萝蛋白酶稳定性的影响研究固定化菠萝蛋白酶能提高 其生物利用度固定化法可使酶构象更加坚牢从而阻止酶构象从折叠态向伸展态过渡 固定化有可能使酶的可逆和不可逆热失活及由变性剂引起的可逆伸展或寡聚酶解离成 活性亚基等过程降低几百倍到几千倍固定化还能保护酶不因蛋白质问相互作用如自 溶或聚合而失活同时也能抑制酶的化学失活菠萝蛋白酶主要以游离酶的形式应用 与底物都处在溶解状态两者均能自由扩散直至碰撞和正确地定向形成酶一底物络合 物但是游离菠萝蛋白酶不能重复地使用且对热不稳定如果储存条件和处理方法不 当活性会减弱固定化法不仅能保持酶原有的高效性专一性温和性及酶的活性可 调节控制性而且产品还有分离回收容易可重复多次使用操作连 续及可控工艺简 便等优点常用固定化酶的方法有吸附共价连接载体截留和胶囊包合等目前已有 很多固定化的菠萝蛋白酶如用有机高分子凝胶为载体制备固定化酶用脱乙苯酰甲壳质 为载体戊二醛为交联剂以共价键的方式固定化酶用脂质膜微胶囊包埋方法制备固 定化酶也有用聚乙二醇为分散剂和稳定剂采用氧化低铁盐的方法制成具有磁性响应 的微球来固定菠萝蛋白酶用一种铁氧纳米粒子为核聚丙烯酸为离子交换基团的复 合物为载体固定菠萝蛋白酶也有用类水滑石一种复合金属氧化物为载体来固定菠萝蛋 白酶蒋荣等人用氨基丙基三乙氧基硅烷改性凹凸棒土来固定化菠萝蛋白酶张 夏红等人用高沸醇木质素及其衍生物对菠萝蛋白酶的吸附来固定化菠萝蛋白酶黄惠 华等研究了磁性载体对菠萝蛋白酶吸附分离和固定化 本课题主要研究的内容意义 以菠萝皮和茎为原料浸提菠萝蛋白酶研究了浸提液中菠萝蛋白酶活性的测定方 法 值温度停留时间稳定剂等因素对浸提液中菠萝蛋白酶稳定性 的影响为 优化菠萝蛋白酶浸提条件提高菠萝蛋白酶的收率提供理论指导根据目前菠萝蛋白酶 生产中存在的技术问题研究了超滤膜分离法浓缩菠萝蛋白酶盐析提纯的工艺条件 为开发简捷高效分离效果好的生产工艺提供理论和技术基础内容 从萝菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白酶的研究 广西大学硕士学位论文 研究了浸提液中菠萝蛋白酶活性的测定方法 研究了温度及停留时间直金属离子种类和浓度多元醇和糖等因素对浸 提液中菠萝蛋白酶活性的影响 盐析法提纯菠萝蛋白酶的工艺条件 超滤膜浓缩菠萝蛋白酶工艺条件 广西大学硕士学位论文 从萝菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白酶的研究 第二章浸提液中菠萝蛋白酶活性检测方法研究 菠萝蛋白酶活性的测定方法目前报道的有四种见表但这些方法都是针对固 体菠萝蛋白酶粗酶和精制菠萝蛋白酶产品活性的测定有关浸提 液中菠萝蛋白酶活性的 测定方法少见报道根据浸提液中成分较为复杂的特性后续实验选用法进行测 定并研究了法对浸提液中菠萝蛋白酶活性测定进行了研究 表菠萝蛋白酶活性测定方法 法测定菠萝蛋白酶活性原理 菠萝蛋白酶活性通过在加入一定半胱氨酸和等物质下使用干酪蛋白作为底物 用菠萝蛋白酶催化水解酪蛋白用蛋白质凝固剂沉淀未水解的酪蛋白用紫外可见分光 光度计在 处检测过滤清液中肽的吸光度菠萝蛋白酶的单位活性定义为酪蛋白在 标准条件?为反应时间为 样品每毫升每分钟释放 的酪氨 酸为单位菠萝蛋白酶酶活 仪器设备 一型紫外可见分光光度计上海光谱仪器有限公司 超级恒温器重庆四达实验仪器有限公司 一型特级捣碎机广州闪明电器有限公司 广西大学硕士学位论文 从萝菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白酶的研究 一精密计上海雷磁 含号转子冷冻高速离心机上海安亭科学仪器厂 卜型磁力加热搅拌器上海精凤仪器有限公司 电子天平精度 余姚市金诺天平仪器有限公司 孑型玻璃仪器烘干器河南省予华仪器有限公司 卜型组织捣碎机江苏金坛市金城国胜实验仪器厂 梅特勒托利多仪器上海有限公司 一电子天平精度 材料与药品 材料与试剂 菠萝茎种植地收集 菠萝果市场购买 菠萝皮工厂收集 三水乙酸钠分析纯 国药集团化学试剂有限公司 广东西陇化工厂 氯化钾分析纯 苯甲酸钠分析纯 广州新港化工厂 三氯乙酸分析纯 上海三爱思试剂有限公司 广西师范学院化学试剂厂 盐酸分析纯 卜半胱氨酸生化试剂 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 干酪素化学纯 三羟甲基胺基甲烷生化试剂 上海蓝季科技发展有限公司 乙二胺四乙酸二钠分析纯 广州化学试剂厂 上海四赫维化工有限公司 无水硫酸镁分析纯 磷酸二氢钠分析纯 国药集团化学试剂有限公司 汕头市化学试剂厂 磷酸氢二钠分析纯 冰乙酸分析纯 国药集团化学试剂有限公司 菠萝蛋白酶样品 泰国 菠萝蛋白酶样品 和光纯药工业侏式会社 广西大学硕士学位论文 从萝菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白酶的 研究 浸提液制备 将菠萝果或废弃物菠萝果芯菠萝皮和菠萝茎洗净并切成碎片然 后用榨汁机榨汁 ?下离心去除 汁液用目滤布移除纤维等物质过滤液在 不溶性物质将滤液放入冰箱?下储存以备后用 分析试剂配制 取 蒸馏 ?缓冲液 三羟甲基氨基甲烷溶于? 水中用 的盐酸在?温度下将值调定容至时值应为 一半胱氨酸和 ?底物活化溶液取此溶液须当天现 溶于值已调至的缓冲液用缓冲液定容至 配 ?底物溶液准确取一定质量的酪蛋白用于生物学目的符合标准 用 蒸馏水调和加了 的氢氧化钠溶液后用一电磁搅拌器在?温度 下搅动 直至所有酪蛋白都溶解加 缓冲液和 底物活化溶液 此溶液须当天现配 将?温度下的值调至并用缓冲液定容至 一半胱氨酸 和 氯酸 ?酶活化溶液取 钾溶于缓冲液将值调至并用缓冲液定容至 此溶液须当天现 配 酶溶液中应有卜 须 ?酶标准溶液将酶溶于酶活化溶液中 到测定即将开始时才可把酶溶液加热至? ? 蛋白质凝固剂取 三氯醋酸 三水醋酸钠此 和 冰醋酸溶于蒸馏水中并定容至 的盐酸中并 ?酪氨酸标准溶液取 酪氨酸乩溶于用 的盐酸定容至 此溶液含 有 酪氨酸浓度为 的溶液在 处的吸光度为 蛋白凝固剂用分 ?滤纸检验要检验滤纸是否合适试验时要用滤纸过滤 光光度计 以示过滤的蛋白质凝固剂为参比测定滤液的吸光度此吸光度不得大 于 广西大学硕士学位论文 从萝菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白酶的研究 浸提液酶试样的制备 准确称取一定量上述制备的浸提液移入 容量瓶中用酶活化溶液稀释到刻 度进行酶活性测定 操作步骤 用移液管将 底物溶液滴入一支试管并置于?的水浴中调温然后加 预热过的酶试样浸提液配制溶液混合精确保温 后加入 蛋白凝固 剂使反应终止让样品试液继续在水浴中静置 然后过滤分光光度计 以空白为参比测定试样的吸光度 比色皿见表 表 法检测菠萝蛋白酶活性操作表 主值 空白值 底物溶液? 一 酶溶液? 混合在温度下精确保温 蛋白质凝固剂 振荡在水浴中继续静置 然后过滤用分光光度计 以空白值为参 比测定吸光度 用以下公式计算酶试样的单位活性 去 处酶试样的的吸光度 式中 所用酶试液中含酶试样的质量 每 处酪氨酸溶液 的吸光度 一一反应时间 阻一法测定的酶试样单位酶活 结果与讨论 滤纸检验结果 从萝菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白酶的研究 广西大学硕士学位论文 表滤纸检验结果 用滤纸过滤 蛋白质凝固剂用分光光度计 以示过滤的蛋白质凝固剂为 参比测定滤液的吸光度吸光度都小于说明滤纸符合实验要求 底物溶液浓度的影响 根据酶催化反应机理当反应体系中底物浓度大于一定数值时其反应速率将不随 底物浓度的变化而变化酶的活性测试最好在底物浓度不影响反应速率这一区域中进 行改变底物浓度操作按表酶试样浓度为 浸提液实验结果见表 表底物浓度对法检测菠萝蛋白酶活性的影响 从上述实验可知当底物酪蛋白浓度大于 时浸提液中菠萝蛋白酶活 性基本不再发生变化测定时底物酪蛋白浓度应大于 浸提液稀释倍数的影响 浸提液改变稀释倍数实际上是改变了试样酶的浓度当稀释倍数 太大或太小既试 样中酶浓度太低或太高时反应后的试样液吸光度有可能超出线性范围影响测定的准 确度取一定质量的浸提液改变稀释倍数配制酶试样酶试样中酶活性测定操作按表 底物酪蛋白浓度 一实验结果见表 表浸提液浓度对检测菠萝蛋白酶活性的影响 从上述实验可知当浸提液的稀释倍数大于倍时浸提液中菠萝蛋白酶活性测 定结果基本不再发生变化测定时浸提液的稀释倍数应大于倍 广西大学硕士学位论文 从萝菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白酶的研究 蛋白质凝固剂用量对菠萝蛋白酶单位酶活的影响 测定过程中加入蛋白质凝固剂主要作用是终止酶催化反应如果加入的蛋白质凝固 剂不能将酶失活及时终止反应将影响测定结果的准确性蛋白质凝固剂对菠萝蛋白 酶单位酶活的影响实验结果见表底物酪氨酸浓度 浸提液稀释倍数 倍 表蛋白质凝固剂用量对法检测菠萝蛋白酶活性的影响 标准法中选用蛋白质凝固剂用量为 从实验结果知对本实验浸提液中酶 活性测定过程蛋白质凝固剂用量大于 后菠萝蛋白酶活性测定结果基本稳定以 后的测定采用加入蛋白质凝固剂 加标回收实验 为验证测试条件的适应性进行了加标回收实验取标准酶样品配成一定浓度的 酶溶液加入到浸提液试中测定加标后试样酶活并计算酶活的回收率实验结果见 表其他实验条件反应温度?蛋白质凝固剂表加标回收实验结果 从上述实验结果可知酶活的加标回收率在一之间法可用于测定浸 提液中菠萝蛋白酶的活性 菠萝各部位酶活性的测定 将相同质量的菠萝果菠萝果芯菠萝皮和菠萝茎洗净并切成碎片然后用榨汁机 榨汁汁液用目滤布移除纤维等物质过滤液在 ?下离 心去除不溶性物质得到的清液称重测定其中菠萝蛋白酶的活性 实验结果见表 从萝菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白酶的研究 广西大学硕士学位论文 表菠萝各部位的酶活性 从上述测定结果可知茎中的酶活含量较高菠萝果和菠萝皮次之菠萝芯最低 本章小结 用法检测菠萝各部位浸提液中菠萝蛋白酶酶活是可行的由于不同部位 的单位酶活大小差异较大在检测时应对稀释倍数进行调整以使其能较准确地检测单 位酶活 测定了菠萝各部位的酶活性其中菠萝茎中含量较高皮与菠萝果较接近 也可作为生产原料 广西大学硕士学位论文 从萝菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白