肥大细胞激活及组织胺水平测定_cropped

肥大细胞激活及组织胺水平测定_cropped 肥大细胞激活及组织胺水平测定 1 2 何韶衡李萍 ( ) 1. 汕头大学医学院 变态反应学与炎症学研究所 汕头 515031; 2. 四川大学华西临床医学院 检验系 【内容摘要】 目的 建立肥大细胞激活及组织胺测量的实验研究系统。 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 将手术切除的人类肺、皮肤、扁 桃体及关节滑膜组织剪碎后, 在 37?条件下用 型胶原酶和 型透明质酸酶进行消化。经洗净及肥大细胞计数后,ll 悬浮的细胞被均匀地加入含刺激剂、抑制剂或缓冲液的试管中, 并在 37?条件下培养 15 分钟, 用冷 缓冲液 HB SS 及离心方法终止上述反应, 取上清液置- 37?下保存。 用与组织胺特异结合的玻璃纤维为基础的荧光显色法测量 组织胺。 结果 肺、皮肤、扁桃体和关节滑膜组织的肥大细胞分别占相应组织悬浮细胞总数的 4% 、5% 、0. 5% 和 4% 左右。各组织中肥大细胞自发性组织胺释放量均占其组织胺总量的 9% 以内。绵羊抗人 和钙离子载体的最 IgE 佳浓度分别是 1% 和 1 ƒ其分别能引起高达 19% 和 56% 的肥大细胞组织胺释放。肥大细胞类胰蛋白酶抑 , Λm o lL () 制剂亮肽素 亮肽素能抑制 依赖性肺及扁桃体肥大细胞的激活。结论 酶消化法分离肥大细胞为肥大细胞激 IgE 发试验提供了快速、重复性好的试验基础。以玻璃纤维特异性结合组织胺为基础的组织胺测量方法重复性好、样品 用量小, 节省人力及财力。绵羊抗人 和钙离子载体均为肥大细胞的有效激活剂。亮肽素能抑制 依赖性肥大 IgE IgE 细胞的激活。 【关键词】 肥大细胞 组织胺 【中图分类号】 392. 1R 3 3 , .,Cha llen ge of M a st Ce ll an d M ea surem en t of H istam in e H e S h a o h e n g L i P in g I nf lam m a t ion I ns t itu t ion , 515000, M ed ica l S ch ool of S h an tou U n iv e rs ity Sh an to u C h ina 【A bstrac t】 O bjec t ive T o e stab lish a sy stem fo r m a st ce ll study inc lud ing d isp e r sio n and ch a llenge o f m a st . , , ce ll and m ea su rem en t o f h istam ineM e thods Sm a ll t issue f ragm en t s cu t f rom lungsk in to n sil and syno v ium . w e re d ige sted w ith co llagena se and h ya lu ro n ida seC e ll su sp en sio n w a s th en d iv ided in to each tube co n ta in ing st im 2 , . u lu sinh ib ito r o r buffe r a lo neT h e reac t io n s in tube s w e re te rm ina ted by add it io n o f co ld HB SS and imm ed ia te . . cen t r ifuga t io nH istam ine w a s m ea su red by u sing a g la ss f ibe r ba sed f luo re scence a ssayRe sults M a st ce lls co n2 4. 0% , 5. 0% , 0. 5% 4. 0% , , , sist o f and o f to ta l d isp e r sed ce lls f rom lungsk in to n sil and syno v ia l t issue sre sp ec2 . 9% . t ive lySpo n taneo u s h istam ine re lea se f rom th e abo ve fo u r t issue s w a s low e r th an o f to ta l h istam ineT h e op t i2 2ƒ1% 1 , 19% m um co ncen t ra t io n s o f an t ih istam ine o r ca lc ium io nop ho re w e re o r Λm o lL w h ich co u ld induce o r 56% . , 2h istam ine re lea se re sp ec t ive lyA n inh ib ito r o f t ryp ta seleup ep t ine w a s ab le to inh ib it IgE dep enden t to n sil . m a st ce ll ac t iva t io nCon c lus ion E stab lishm en t o f a m a st ce ll ac t iva t io n sy stem w ill co n t r ibu te g rea t ly to inve st i2 .ga t io n o f m ech an ism s o f m a st ce ll ac t iva t io n and d isco ve ry o f no ve l m a st ce ll stab ilize r s H istam ine 【Key words】 M a st ce ll ( , 作为肥大细胞激活的指标, 组织胺的测定则 功之前作为初级反应细胞, 肥大细胞在过敏症 an a2 ) 具有重要的价值。本研究建立了酶悬浮法分离肺、皮 发病机制中起着十分重要的作用, 被称之 p h y lax is 为人体中唯一能将人致死的细胞。 肥大细胞是通过 肤、扁桃体及关节滑膜组织的肥大细胞, 肥大细胞的 激活后释放多种生物活性物质, 如组织胺、类胰蛋白 体外激活及一种方便、可靠的组织胺测定方法, 现报 酶、类糜蛋白酶、肝素、及多种白细胞介素来实现其 道如下。 功能的。1 材料和方法 到目前为止, 研究肥大细胞的主要手段和模型 都集中在啮齿类动物身上。因此, 建立一个可靠的研 1. 1 材料 究人类肥大细胞功能的体外试验方法, 将对人们认 l 型胶原酶, l 型透明质酸酶, 钙离子载体, 组 识肥大细胞自身功能和该细胞与其它细胞的联系, 织 胺, 均购自 。 细胞基 础 培 养 液, O PD S igm aU K () 以及研究肥大细胞稳定剂等药物有着难以估量的意M EM 购自 G ib co , U K。 绵羊抗人 IgE 抗体购自1 义。 在具有敏感的测定类胰蛋白酶的方法研究成。组织胺测定仪, , Se reo tech U KL eu db eck D iagno s2 , 即对肥大细胞的稳定作用越强, 反 制剂的作用愈大t ic s, D enm a rk。 1. 2 方法之亦然。 抑制效果用百分抑制率来 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 示。 11213 细胞激活及抑制 将 10 的细胞悬液混 Λl 手术切除的人肺、皮 1. 2. 1 组织消化与细胞分离于等量的阿辛蓝染液中, 20 分钟后, 加到血细胞计 , 用剪刀 肤、扁桃体及关节滑膜组织经培养液冲洗后数器上并在显微镜下计数。 经用含 2% 小牛血清的 在中细细地剪碎。经含 2% 小牛血清的M EM M EM 洗涤 3 次后, 将细胞悬浮于含 1. 8 氧 ƒHB SS mm o lL () 洗 3 次 2000 ?, 6 分钟后, 将其与胶原酶 , 37ƒrm in 化钙及 0. 5 氧化镁的 中, 并立即加 ƒmm o lL HB SS ( 1. 5 ƒƒ肺或 扁 桃 体 组 , 10 m g m l M EM m l M EM g 入装有激活剂、抑制剂、或两者都有的试管中, 每管 织; 2. 0 皮肤或关节滑 , 15 ƒƒm gm l M EM m l M EM g 100 。快速混匀后, 立即计时。一般情况下, 激活剂 Λl)()膜组织、透明质酸酶 用量为胶原酶的一半、2% 小 与细胞混合后 15 分钟终止反应。 方法为: 立即将试 牛血清及 2% 青、链霉素溶液混合, 共同在 37?摇动 管从 37?水浴箱中拿出, 放到冰上, 并加入 150 Λl (水箱中培养 60, 75 分钟 肺组织 65 分钟, 扁桃体组 )(的冷 不含钙、镁离子。 尽快地将试管在 4? HB SS 2 ) 织 60 分钟, 皮肤和滑膜组织 75 分钟。 用孔径为 ( ) 条 件下离心 2000 ƒ使细胞与上清液 , 10, rm in m in 100 的筛网将细胞与未消化的残留组织碎片分 Λm 分离。分离后的上清液存入小塑料瓶中, 在- 20?条 件下保存。 ( ) 离开。 经 3 次洗涤 条件如前后, 将细胞悬浮于含 1. 2. 4 组织胺测定 采用丹麦参考实验室 的组织 () 胺测量仪。样品、缓冲液及组织胺 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 液 50 ƒn gm l 中, 并在一 10% 小牛血清及 2% 青链霉素的 M EM (分别加入特制的纤维玻璃包被的 96 孔盘内 此盘对 个滚动混合装置上, 室温下培养约 16 小时。 11212 激活剂与抑制剂的准备和实验结果表达 抗体和钙离子载体是最常用的肥大细胞激活 IgE 剂, 均需保存在- 20? 的条件下。 为避免反复冻融 ) 平行样品。在 组织胺有特异性亲和力, 每孔 50 Λl, 引起活性降低, 新购入的刺激剂要进行分装, 在试验 37?的干燥培养箱内培养 1 小时后, 蒸溜水冲洗。然 当天将其放在冰上缓慢解冻。抑制剂为亮肽素, 是一 种非特异性的类胰蛋白酶抑制剂。刺激剂、抑制剂的 后每孔加入 150 的 0. 4% 溶液, 在 37? 下 Λl SD S 准备和加入试管的过程均在冰上进行。 稀释液为含 培养 30 分钟。再用蒸溜水冲洗后, 在每孔内加入 75 钙、镁离子的 。 对观察抑制剂作用的试验而 HB SS( 结合剂 包括 0. 5 ƒ和, 5% Λl m gm l O PD m e sh an d 言, 对照管内加入 25 刺激剂或抑制剂, 然后再加 Λl ) 2ƒ室温下避光培养 10 分钟。 最后每 , m gm l N aO H 入 25 缓冲液使每管的总液量达到 50 。而试验 Λl Λl ( 管 内 则 加 入 刺 激 剂 和 抑 制 剂 各 25 总 量 为 50Λl 孔内加入 75 的 58 以终止组织ƒ4 Λl mm o lL H CL O )胺与 的反应。。只含缓冲液的试管则作为自发性或全部组织胺 O PD Λl θ 1. 2. 5 统计学方法 全部数据均以 ?表示。 采 释放的对照管, 将其中 4 管在沸水内煮沸 6 分钟后 xs 用配对 检验 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 刺激剂组及抑制剂组之间的差放入冰内冷却, 使细胞内的组织胺全部释放出来, 即 t 全部组织胺。 组织胺释放率按下式计算。 异。 ( 组 织胺释放率= 组织胺释放量- 自发性组织胺释放 ) 结果2 量?全部组织胺量×100% 激活剂能使组织胺释放量增加, 释放率为正值。 经酶消化悬浮的细胞中, 肺、皮肤、扁桃体和关 激活剂作用越强, 正值越大。 根据显效时间的长短, 节滑膜的肥大细胞数量及经激活和抑制后肥大细胞 在加入刺激剂之前或加入刺激剂的同时将抑制剂加 入肥大细胞。减少激活剂对细胞作用的能力愈强, 抑 组织胺的释放结果见表 1。 10 亮肽素能够抑制 35% 的 依赖性 ƒΛgm l IgE () 肺肥大细胞组织胺释放 = 6, = 0. 028, 而对扁n P 桃体肥大细胞而言, 要取得相似程度的组织胺释放 θ() 表 1 肥大细胞数量及组织胺释放结果 ?, % x sθ() 1 ?, % Table The am oun t of ma st ce ll an d the re sults of h istam in e re lea se x s L ungSk inT o n silSyno v ium()()()() n = 14 n = 12 n = 14 n = 14 ?0. 9 ?1. 0 ?0. 06 ?1. 4 4. 25. 20. 53. 8M a st ce llƒto ta l ce ll ƒN a tu re h istam ine re lea seto ta l h istam ine 8. 6?1. 28. 5?0. 75. 7?0. 48. 9?0. 9 1% H istam ine re lea se st im u la ted by IgE 19. 0?4. 311. 0?4. 017. 0?2. 312?7. 2 H is tam ine re lea se s t im u la ted by ca lc ium io nop ho re 48. 0?6. 9 24. 0?8. 3 56. 0?4. 4 46. 0?6. 9 ( 性刺激物钙离子载体虽然有引起细胞浆内钙离子浓 抑 制 率, 则 需 要 100 Λgƒm l 的 亮 肽 素 n = 7, P = )010473。亮肽素不能有效地抑制 依赖性关节滑 , 也只能引起低于 56% 的组织胺 度明显增加的能力IgE 膜肥大细胞组织胺释放, 亦不能有效抑制钙离子载 释放。这意味着肥大细胞不能实现全部脱颗粒反应。 体引起的组织胺释放。不同组织中的肥大细胞对同一浓度的同种刺激剂的 反应程度不同早已被人们发现, 这种现象被称之为3 讨论 ( ) 肥大细胞的异源性 , 本试验结果进 h e te ro gen e ity 一步地证实了此问题。 亮肽素作为非特异性的类胰 酶消化悬浮肥大细胞法的产生及逐步完善, 为 蛋白酶抑制剂能对 依赖性肥大细胞激活有抑制 IgE 研究肥大细胞及其稳定剂开创了广阔的前景。 其优 作用, 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 以其活性型式存在的肥大细胞类胰蛋白 点在于: ?使细胞脱离组织支架而便于均匀加样, 试 3验可重复性好; ? 混合有多种其它类细胞, 使肥大 酶可能参与肥大细胞的激活2分泌过程。 因此, 此 细胞除能接受直接刺激外, 还可接受间接刺激; ?耗 类抑制剂有望成为一种新型的肥大细胞稳定剂。 时少。 参 考 文 献 采用 研制的组织胺测定 L u rdb eck D iagno st ic s 1 W a lls A F. M a st ce ll p ro tea se s in a sthm a. In: H o lga te ST , 仪及特制的玻璃纤维结合组织胺的技术, 使组织胺 , . . B u sse WW ed sInf lamm a to ry m ech an ism s in a sthm aN ew (()的测量达到微量水平 1 ƒ、数值可靠 直接显 n gm l: , 2002: 1202200Yo rkM a rce l D ek k e r )示组织胺量、省时、价廉, 样本需求少, 大大减少了 2 , , . H e SGaca M DA W a lls A FA ro le fo r t ryp ta se in th e ac t iva2 肥大细胞的需要量。 因此, 有推广前景。 虽然在上: t io n o f h um an m a st ce llsm o du la t io n o f h istam ine re lea se by 述四种组织之间, 肥大细胞的百分率 . ,t ryp ta se and inh ib ito r s o f t ryp ta seJ P h a rm aco l E xp T h e r 1998; 286: 289 ( 有一定的差异, 其平均值为 4% 左右 除扁桃体组织 , . . : ) 3 C h u rch M K C auf ie ld J PM a st ce ll and ba sop h il func t io n sIn外, 但此类细胞在组织中的数目是相当可观的。 因 , , . . : H o lga te ST C h u rch M K ed sA lle rgyL o ndo nGow e r M ed i2 此, 有着积极参与组织生理及病理过程的客观基础。 2120, 1993: 89ca l P ub lish ing 从本实验的数据中可以看出, 与 有关的刺激仅 IgE ( )能引起少于 20% 的肥大细胞组织胺释放, 而非生理 2002202208 收稿, 2002203222 修回 编辑 罗惠坤 3 H o tom i, M , Sam uk aw a T. In te r leuk in 28 gene in o t it is m ed ia ()上接第 585 页 度最高, 而浆液性 最低, 符合中耳炎病理组 1992; 118 T C E w ith effu sio n. A c ta O to la ryngo l H ead N eck Su rg, 织变化。中耳炎的治疗在临床上是较为棘手的问题。 ( ) 2: 745 在中耳炎的发病机理中, 嗜中性白细胞受到炎性病 , , . 28F itzge ra ld J E B u r le so n JA et a lIn te r leuk in 4 M axw e ll KS, 理刺激而产生 28, 而 28 又可加强中耳炎的炎 IL IL ( ) . , 1994; 104 12: 989 exp re ssio n in o t it is m ed iaL a ryngo scop e3, 4, 8 性变化, 两者之间互为联系。 嗜中性白细胞在 . 28 5 B ick le M T h e ro le o f in te r leuk inin inf lamm a t io n and m ech a2 9 许多病变过程中可以毁损组织, 也即从某种角度 ( ) . , 1993; 64 5: 456n ism o f regu la t io nJ p e r io do n to l 说, 嗜中性细胞在中耳炎会造成中耳粘膜的破坏。结 , . 28 6 Sm a r t SJ C a sa le TBIn te r leuk in induced t ran sce llu la r neu2 合本研究, 我们认为通过 28 拮抗剂抑制嗜中性白 IL t rop h il m ig ra t io n is fac ilita ted by endo th e lia l and p u lm o na ry ep 2 (细胞的聚积和激活, 可望成为治疗中耳炎 包括急慢 ( ) . , 1993; 9 5: 489ith e lia l ce llsA m J R e sp ir C e ll M o l B io l ) 性化脓性中耳及分泌性中耳炎的一种新途径。 , . . B a r t le t t J GF ro gga t t JW A n t ib io t ic re sistanceA rch O to 2 7 ( ) , 1995; 121 6: 392la ryngo l H ead N eck Su rg , , , . M ah ida YR C e sk a M E ffenbe rge r F et a lE nh anced syn th e2 8 21ƒ28 sis o f neu t rop h il ac t iva t ing p ep t idein te r leuk inin ac t ive u l2 参 考 文 献 () ( ) . , 1992; 82 2: 273ce ra t ive co lit isC lin Sc i Co lch . . ,W e iss SJT issue de st ruc t io n by neu t rop h ilsN E ng l J M ed 9 1 P ap a re lla, M M , S ip ila P , J uh n SK , et a l. Subep ith e lia l sp ace in ( ) 1989; 320 3: 365 ( ) o t it is m ed ia. L a ryngo scop e, 1985; 95 3: 414 ( )2002205231 收稿, 2002207215 修回 2 , , , , . Ga rv isW J L ee s CJ L e C T et a lD e te rm in ing o t it is m ed ia 编辑 沈 进 . seve r ity f rom m idd le ea r f lu id ana ly sisA nn O to l R h ino l L a ryn2 ( ) , 1994; 103 2: 43go l