pcr实验报告[最新版]

pcr实验报告[最新版] --------------------------------------第X页 共X页------------------------------------------- pcr实验报告 pcr实验报告 篇一:PCR实验报告 PCR实验报告 7月19日 高遄 实验目的:了解PCR技术原理，掌握最基础的PCR实验步骤。 实验试剂:模板DNA，Mg2+，buffer，dNTPs，Taq DNA聚合酶，引物， H2O，石蜡油。 实验原 理: ? PCR全称聚合酶链反应，是体外快速扩增特定基因或DNA 序列最常用的方 法。 ? 基本原理:首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加 热分离成2条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反 应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新的DNA互补链。PCR反应时， 只要在试管内加入模板DNA、PCR引物、四种核苷酸及适当浓度的Mg2+， DNA聚合酶就能在数小时内将目标序列扩增100万倍以上。 (1) 双链模板DNA分子首先在高温下解开成长的单链，短链引物 分子立即与该模板DNA 两端的特定序列相结合，产生双链区。 (2) DNA聚合酶从引物处开始复制其互补链，迅速产生与目标序 列完全相同的复制品。 (3) 在后续反应中，无论是起始模板DNA还是经复制的杂合DNA 双链，都会在高温下解 开成为单链，体系中的引物分子再次与其互补序列相结合，聚合酶也 再度复制模板DNA。 (4) 由于在PCR反应中选用的一对引物，是按照与扩增区域两端 序列彼此互补的原则设计 的，因此每一条新生链的合成都是从引物的退火结合位点开始并朝反 方向延伸的，每一条新合成的DNA链上都有新的引物结合位点。 --------------------------------------第X页 共X页------------------------------------------- (5) 整个PCR的反应全过程，即DNA解链(变性)、引物与模板 DNA结合(退火)、DNA 合成(链的延伸)三步可以被不断重复。经多次循环之后，反应混合 物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段 的拷贝数，理论上的最高值应该是2^n，能进一步满足遗传分析的需 要。 ? 试剂作用: (1) 引物:DNA复制的起始点，针对复制DNA片段的两端，有5’ 引物和3’引物 (2) Taq DNA聚合酶:促进dNTPs与模板结合。 (3) Buffer:Tris-HCl反应缓冲液，Taq DNA聚合酶提供一个最 适酶催反应条件。 (4) Mg2+:对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增 的特异性，浓度过低则 影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 (5) dNTPs:底物，在引物引导下合成与模板互补的DNA新链。 (6) 石蜡油:防止PCR加热过程中DNA蒸 发。 ? 试剂配置体积: (1) 热启动:94?，5~10min (2) 变性:94?，45~60s。 (3) 退火:50~65?，1min。退火温度计算:Tm-(5?~10?)， Tm(解链温度)=4(G+C) +2(A+T)。 (4) 延伸:72?，1~1.5min。 (5) 步骤 (2)~ (4)热循环25~30个周期 (6) 保温:延伸72?， 10min ? 产物检测:凝胶电泳。 --------------------------------------第X页 共X页------------------------------------------- 实验步骤: (1)设计20μl体系各试剂配比: (2)按照预先设计的20μl体积配置6管试管量，实际加入量如 下 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf (3)完成后分6管加入pcr管中，每管15μl体积，标注1-6号 码。 (4)在前1-~4号PCR管中加入模板DNA，在5号管中加入C3H模 板作为阳性参照，6号中不加任何模板DNA，作为阴性参照。 (5)在加完模板的6管试剂中各加入20μl石蜡油 (6)将PCR管放入 PCR仪，按之前设定的加热温度与时间设置 a(热启动:94?，2min;80?，1min; 此时在各管中加入dNTPs 4μl b(变性:94?，30s; c(退火:65?，1.5min; d(延伸:72?，2min 步骤b~d循环40次 e(保温:72?，10min (7)完成后用3%琼脂糖凝胶(60ml)电泳进行检测。 实验结果: PCR目标产物约为295bp 琼脂糖凝胶电泳结果如下图所示 1 2 3 4 5 6 Marker 1、2号泳道为?性小鼠DNA模板的PCR产物 3、4号泳道为?性小鼠DNA模板的PCR产物 5号泳道为C3H阳性参照 6号泳道为阴性参照 由Marker参照可知，PCR产物大小约为290~300bp篇二:聚合酶链 式反应PCR实验报告 实验二 聚合酶链式反应(PCR) --------------------------------------第X页 共X页------------------------------------------- 一、 实验原理 聚合酶链式反应(PCR)是利用DNA片段旁侧两个短的单链引物，在 体外快速扩增特异DNA片段的技术。它应用热稳定的聚合酶，通过双 链DNA模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环，DNA片段以 指数方式增加了百万倍。从非常微量的DNA甚至单个细胞所含有的 DNA起始，可产生ug量的PCR产物。 二、 器材与试剂 1.器材:移液器，EP管，热盖PCR仪，电泳仪，量筒，锥形瓶，微 波炉，电子天平，紫外照色仪 2.试剂:引物，模板，Taq DNA聚合酶，原料(dNTPs)，缓冲液与Mg2+， H2O, 2*PCRmix溶液，DNA染料 三、 实验步骤 PCR反应体系的建立 取离心管，依次加入试剂混匀 1(H2O 12μl 2(模板 1μl 3(引物T7 1μl 4(引物 sp6 1μl 5(2*PCRmix 15μl PCR仪的热循环反应 把离心管放入PCR仪中，由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成 1. 模板DNA的变性:模板DNA经加热至94?左右一定时间后，使模 板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便 它与引物结合，为下轮反应作准备; 2. 模板DNA与引物的退火:模板DNA经加热变性成单链后，温度降 至56?左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合; 3. 引物的延伸:经加热至72?左右DNA模板--引物结合物在TaqDNA 聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补 配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复 制链。重复该循环30次，每次需要2-3分钟。 电泳检测结果 --------------------------------------第X页 共X页------------------------------------------- 扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中，电泳结束后，放到紫外照射仪中进行 透射，电泳明胶显示清晰的条带，如下图所示 加入的为1号样，出 现在500bp左右条带，而预算结果为扩增出492bp条带，故实验成功。 四、 讨论 1. Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩 增的特 异性浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不 出扩增条带。 2. 变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低， 可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与 模板的结合而降低PCR扩增效率。 3. EB:溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖中 的DNA，可与DNA结合，用 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 302nm 紫外光透射仪激发并放射出橙 红色信号。 4. 溴酚蓝:电泳指示剂，相当于300bp的DNA的电泳速度。 5. 100bp DNA Marker?是由单独的PCR扩增产物混合而成，已含有 1xLoading Buffer,可以直接电泳。包括11条双链DNA片断:100bp、 200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp 和1500bp。特异性加强500bp。每次上样4,5μL。 6. 模板一般采用50ng-1ug或102--105 拷贝，浓度过高反而会抑制 反应的进行。 7. 引物的与模板的互补程度决定了PCR的特异性，常用0.1—0.5uM， 浓度过高则特异性下降，会形成引物二聚体影响试验结果。 五、 结果及结论: 经电泳检测到PCR扩增产物中出现500bp左右条带，PCR扩增成功。 篇三:PCR扩增反应的操作实验报告1 PCR扩增反应的操作实验报告 实验原理: 以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的 情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板 DNA得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片 段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜 --------------------------------------第X页 共X页------------------------------------------- 板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。反应时先将上 述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态;然后 降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链， 称为退火;再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以 dNTP为原料，引物沿5’?3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片 段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低 温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩 增。因此PCR循环过程为三部分构成:模板变性、引物退火、热稳定 DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成。 实验步骤: 一、PCR反应的条件 PCR反应条件为温度、时间和循环次数。 1( 温度与时间的设置 (1) 变性温度与变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主 要原因。 一般情况下，93?,94? lmin足以使模板DNA变性，若低于93?则 需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此 步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。 (2) 退火(复性)温度与退火温度是影响PCR特异性的较重要因 素。变 性后温度快速冷却至40?,60?，可使引物和模板发生结合。由于 模板 DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板 互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成 及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50% 的引物，55?为选择最适退火温度的起点较为理想。 (3) 延伸温度与Taq DNA聚合酶的生物学活性:70,80?，150 核苷酸 /S/酶分子;70?，60核苷酸/S/酶分子;55?，24核苷酸/S/酶分子; 高于90?时，DNA合成几乎不能进行。 --------------------------------------第X页 共X页------------------------------------------- (4) PCR反应的延伸温度一般选择在70,75?之间，常用温度为 72?，过高 的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据 待扩增片段的长度而定，一般1kb以内的DNA片段，延伸时间1min 是足够的。3,4kb的靶序列需3,4min;扩增10kb需延伸至15min。 延伸进间过长 会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍 长些。 2(循环次数 循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓 度，一般的循环次数选在30,40次之间，循环次数越多，非特异性 产物的量亦随之增多。 二、PCR扩增产物分析 PCR产物是否为特异性扩增，其结果是否准确可靠，必须对其进行严 格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研 究对象和目的不同而采用不同的分析方法。 1(凝胶电泳分析:PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初 步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是 多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起 码条件。 (1)琼脂糖凝胶电泳:通常应用1,2%的琼

脂糖 凝胶，供检测用。 (2)聚丙烯酰胺凝胶电泳:6,10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果 比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。 2(酶切分析:根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、 电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能 对靶基因分型，还能进行变异性研究。 实验结果:无篇四:DNA提 取+PCR+电泳实验报告 题目:水稻DNA提取，扩增与电泳实验 组别:第三组 --------------------------------------第X页 共X页------------------------------------------- 一、1掌握DNA的提取技术2掌握PCR的相关操作3掌握了解电 泳操作方法和步骤 二、实验原理:1、提取DNA一般用水稻幼叶，先用机械方法液氮 研磨植物组织使组织细胞破碎，然后加TPS抽提液水浴提取DNA，最 后用无水乙醇沉淀DNA即可。(DNA提取原理) 2、DNA在高温时可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为 双链。(PCR原理)3、琼脂糖凝胶电泳:借助琼脂糖凝胶的分子筛作 用，核酸片段因其分子量或分子形状不同，电泳移动速度有差异而分 离。 三、实验仪器和药品 液氮、镊子、手套、移液枪、枪头2ML和1.5ML离心管、水稻幼叶、 研磨棒、琼脂糖、天平、PCR仪、Loading Buffer染色剂、灭菌双蒸 水、摇床、离心仪、Taq酶、Mg2+Buffer、dNTP溶液、引物、TPS抽 提液、无水乙醇、电泳槽、GoldVie、TBE溶液、微波炉、锥形瓶、 量筒、PCR板、PCR盖、水浴箱、Marker 四、实验步骤 1、DNA提取 (1)取水稻叶子少量置于2ML离心管内，加入液氮研磨，带磨成 粉状后，加1MLTPS抽提液，然后将离心管放入75?恒温水浴箱中至 少半小时。同时将无水乙醇放入-40?下冷冻 (2)水域结束后，取出离心管放入离心仪中，13600r/min离心 12min，然后小心的取出离心管，将上清液转移到1.5ml离心管中 0.5ml，加入600ul冷冻的无水乙醇，放入-80?下冻10min，拿出放 入离心仪13600r/min离心5min (3)到处上清液，倒置，晾干约3h (4)加入双灭菌水60ml，放入摇床中振荡一夜。 2、PCR (1)按所需配料表，向PCR板中加入双蒸水,mix,前引物，后引物， 然后加入提取的DNA，混匀 (2)将PCR板放入PCR仪中运行SSR程序 3、电泳 --------------------------------------第X页 共X页------------------------------------------- (1)称取0.3g琼脂糖和30mlTBE溶液。混匀倒入锥形瓶中，加热 溶解混匀。待冷却至不烫手时加入GoldVie，混匀，倒入已经插好梳 子的配胶槽中，冷却30min至1h (2)将冷却好的凝胶拔掉梳子后放入电泳槽中(将有点样孔的一 端靠近负极)然后按照顺序点样，每个样的用来那个为4ul，在中间 的空上点Marker溶液3ul (3)打开电泳开关，电泳32min左右 (4)电泳结束后，将胶取出，放入透视镜下照射，拍照，读带 五注意事项 1、 提取dna的时候用乙醇是沉淀时，必须将乙醇冰冻 2、 在PCR之前加2ulDNA时要将枪头插入液面下