毛囊组织DNA提取方法的研究

人头发毛囊组织DNA提取方法的研究 技术保障与研发部 魏宏泉 摘要  本研究以人头发的毛囊组织为 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 ，在动物组织总DNA提取的经典技术 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 基础上，兼顾效率、成本和产率等三方面因素，对毛囊组织DNA提取方法进行了优化，并 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 了实用有效的取样方法。研究结果显示，可以以少至一根带毛囊的头发为材料，在40分钟时间内获得约0.5g组织DNA，其产量和质量可以满足基因检测工作后续流程的需要。同时，一次提取过程所耗药品试剂的成本约为0.3元，大大低于以微量血为材料的试剂盒提取法的成本。 在以RFLP法对线粒体12s rRNA基因1555位点进行基因检测的技术体系中，组织DNA提取是实验室工作的第一步，该工作的效率、质量、成本等因素对整体检测流程具有至关重要的影响。在此之前的研究工作中，我们确定了以微量血为材料提取组织DNA的技术方法，但为了使基因检测项目的实施具有更强的可操作性，设计多样化的组织样本采集形式则是必需的。为此，本研究以人头发毛囊组织为材料，旨在建立适用的取样方法和DNA提取方法的技术体系。 1. 材料与方法 人头发毛囊组织 取自健康成年人。取样方法：用镊子夹住头发根部的部位，顺着毛发生长方向用力一拔即可，此时在毛发根部应明显可见白色或半透明的毛囊组织。然后用剪刀剪去大部分的毛干部分，将毛根带有毛囊组织的部分置于1.5ml Eppendorf管内。 试剂配制 （1） Proteinase K           Proteinase K用去离子水溶解，浓度20mg/ml。 （2） 组织消化液           10mM  Tris-HCl，pH7.5           10mM  EDTA           10mM  NaCl           0.5％  SDS （3） LiCl溶液           无水LiCl用去离子水溶解，浓度为7.5M。 （4） TE溶液           10mM  Tris-HCl，pH7.5           0.1mM  EDTA，pH8.0 参考操作程序 （1） 加入60l消化液，再加入1l蛋白酶K溶液，用涡旋混合器震荡5秒钟。 （2） 于55℃水浴2小时。 （3） 加入60l LiCl溶液，用涡旋混合器震荡5秒钟，冰浴10分钟。 （4） 13 000rpm离心15分钟，将上清移入一个新的离心管中。 （5） 加入240l无水乙醇，颠倒混匀后室温放置10分钟。 （6） 13 000rpm离心10分钟，弃上清，用70％乙醇将沉淀洗一次。 （7） 13 000rpm离心5分钟，弃上清，并将残留乙醇吸干净，室温干燥20分钟。 （8） 加入20l TE缓冲液溶解DNA。 （9） 用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。 头发数量对DNA提取结果的影响 将拔取的头发分为6组，分别为1、2、3、4、5、6根头发，按1.3中的参考操作程序进行操作，提取DNA并用电泳检测结果。 蛋白酶K消化对DNA提取结果的影响 （1） 将拔取的头发分为4组，每组1根，在操作程序中加入蛋白酶K后，55℃水浴时间分别为15分钟、30分钟、45分钟、60分钟，其余步骤按参考操作程序进行。 （2） 将拔取的头发分为6组，每组2根，在操作程序中加入蛋白酶K后，55℃水浴时间分别为0分钟、10分钟、20分钟、30分钟、60分钟，其余步骤按参考操作程序进行。 （3） 将拔取的头发分为6组，每组2根，其中5组在操作程序中加入的蛋白酶K浓度分别为20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml，最后一组不加蛋白酶K，其余步骤按参考操作程序进行。 （4） 将拔取的头发分为5组，每组1根，在操作程序中不进行加入蛋白酶K及水浴步骤，其余步骤按参考操作程序进行。 优化操作程序的多样本比较实验 以五个人为对象，各拔取两根头发作为样本分为两组，每组一根头发，共计10组，以下列操作程序提取DNA： （1） 加入60l消化液，再加入1l蛋白酶K溶液，用涡旋混合器震荡5秒钟。 （2） 于55℃水浴10分钟。 （3） 加入60l LiCl溶液，用涡旋混合器震荡5秒钟，冰浴10分钟。 （4） 13 000rpm离心10分钟，将上清移入一个新的离心管中。 （5） 加入240l无水乙醇，颠倒混匀后室温放置10分钟。 （6） 13 000rpm离心10分钟，弃上清，用70％乙醇将沉淀洗一次。 （7） 13 000rpm离心5分钟，弃上清，并将残留乙醇吸干净，室温干燥20分钟。 （8） 加入20l TE缓冲液溶解DNA。 （9） 用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。 （10） 各取2l DNA溶液作为模板进行PCR，PCR反应体系及程序设置按照“药物性耳聋易感基因检测的RFLP 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 操作程序”进行。 2. 结果与 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 2.1 头发数量对DNA提取结果的影响   以1-6根头发为材料，每组都可以有效提取出基因组DNA，1-3根头发组的DNA产量有较为明显的随头发数增多而产量也增多的变化，3-6根头发组的DNA产量则没有明显差别。如图1所示。 Lane1：一根头发提取DNA的 结果 Lane 2：二根头发提取DNA的 结果 Lane3：三根头发提取DNA的 结果 Lane 4：四根头发提取DNA的 结果 Lane5：五根头发提取DNA的 结果 Lane 6：六根头发提取DNA的 结果 Lane M： MW marker DL 2000 ( 20ng / band ) 1 2 3 4 5 6 M 2000bp 图1 头发数量对DNA提取结果的影响 在图1显示的电泳结果中，第1、2、3条带的亮度逐渐增加，说明随着头发数的增加其相应的DNA产量也随之增加，而第3、4、5、6条带的亮度差异不明显，说明所获得的DNA产量基本相同注。而事实上1-6根头发中所含DNA的量应该是随头发数量增加而递增的，出现这种矛盾现象的可能原因是：相同的消化液和蛋白酶K使用量并不适用于处理不同数量头发。在本实验中，所使用的60l消化液和1l蛋白酶K可能是对应于1-3根头发的合适用量，可以达到完全裂解细胞膜和细胞核并释放DNA的效果，而4-6根头发可能造成了蛋白酶反应底物的过量，这些过量的组织细胞并没有被裂解，因此所释放出的总DNA量仍与1-3根头发释放的DNA量相当。 从电泳结果显示的条带亮度来看，由于所使用的DNA分子量标准每条带的亮度约为20ng，因此可以估测认为，本实验从一根头发中提取出的基因组DNA约为400-600ng，该产量对于基因检测的技术实施来说已经足够，完全可以满足后续工作的需要。 2.2 蛋白酶K消化对DNA提取结果的影响 在蛋白酶K反应体系中，组织样本中细胞的裂解率是受酶促反应时间和酶与底物比例影响的。本实验中各组均以一根头发为材料提取DNA，同时所使用的蛋白酶K适度过量，结果DNA产量出现了随时间而变化的梯度上升。 （1）蛋白酶K消化时间对DNA提取结果的影响。 1 2 3 4 M Lane1：水浴15分钟所提取的DNA Lane 2：水浴30分钟所提取的DNA Lane3：水浴45分钟所提取的DNA Lane 4：水浴60分钟所提取的DNA Lane M： MW marker DL 2000 ( 20ng / band ) 2000bp 图2 蛋白酶K消化时间对DNA提取结果的影响（1） 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 2000bp Lane1-2： 未进行水浴所提取的DNA Lane 3-4：水浴10分钟所提取的DNA Lane5-6：水浴20分钟提取的DNA Lane 7-8：水浴30分钟提取的DNA Lane 9-10：水浴60分钟提取的DNA Lane M： MW marker DL 2000 ( 20ng / band ) 图3 蛋白酶K消化时间对DNA提取结果的影响（2） 从图2可以看出，蛋白酶K消化时间与DNA产量之间的对应关系是：在30分钟之内，细胞裂解率与消化时间成正比，而超过30分钟之后，DNA产量不再增加。产生这一现象的原因可能是：在60l消化反应体系中加入1l蛋白酶K已经达到过量的水平，虽然参考程序中建议消化2小时，但本反应体系在反应进行到30分钟时已经将组织细胞全部裂解。进一步的计算结果表明，该反应体系中蛋白酶K的实际工作浓度为333ng/l，而哺乳动物组织DNA提取的经典技术方案中推荐的蛋白酶K工作浓度一般是100ng/l，本实验中蛋白酶K过量2.3倍，因此，原本应该会产生的随消化时间（30-60分钟时间段）而变化的DNA释放效率因酶的过量而被弥补了。 在图3中可以看出，在进一步的实验结果中也显示了同样的现象：即10-30分钟时，细胞裂解率与消化时间成正比，而超过30分钟之后，DNA产量不再增加。同时我们也可以看到，不进行水浴是无法得到DNA产物的，这也进一步说明了蛋白酶K在消化液成分中的重要性，以及适宜温度对酶促反应的重要性。 （2）蛋白酶K用量对DNA提取结果的影响 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M Lane1-2： 20mg/ml蛋白酶K组 Lane 3-4：10mg/ml蛋白酶K组 Lane5-6： 5mg/ml蛋白酶K组 Lane 7-8： 2.5mg/ml蛋白酶K组 Lane 9-10：1.25mg/ml蛋白酶K组 Lane 11-12：无蛋白酶K组 Lane M： MW marker DL 2000 ( 20ng / band ) 2000bp 图4 蛋白酶K用量对DNA提取结果的影响（1） 1 2 3 4 5 M Lane1-5：无蛋白酶K的平行实验组 Lane M： MW marker DL 2000 ( 20ng / band ) 2000bp 图5 蛋白酶K用量对DNA 提取结果的影响（2） 如图4所示，当使用的蛋白酶K的浓度为20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml时，DNA产量大致相当，其中5mg/ml组较其它两组为少。当使用的蛋白酶K的浓度为2.5mg/ml、1.25mg/ml时，DNA产量较前三组明显减少。无蛋白酶组中只有一个样本有少量DNA产物。将使用的蛋白酶K用量换算成终浓度，则各组中蛋白酶K的工作浓度分别为333.3ng/l、166.7ng/l、83.3ng/l、41.6ng/l、20.8ng/l，如果以100ng/l做为反应体系中蛋白酶K的标准工作浓度，可以在发现2.5mg/ml组和1.25mg/ml组中，蛋白酶K用量显然不足，因此DNA产量较前三组明显减少。 图5显示的是无蛋白酶K及其55℃水浴步骤时DNA提取的结果。将这一结果和图4显示的结果相比较，我们可以发现消化液与蛋白酶K在释放DNA过程中有效反应条件的差异：当无蛋白酶K参与反应时，55℃水浴处理可以增强消化液的作用效果，其结果是也可以释放部分DNA，但如果减去了水浴处理步骤，在室温条件下，消化液则不能起到有效释放DNA的作用。参照图3显示的酶促反应条件结果，即便消化液与蛋白酶K同时存在，如果不进行55℃水浴处理仍然不能起到应有的作用。这些实验结果说明，基本消化液成分对于蛋白酶K功能实现是必需的，同时适宜温度也是必要条件之一。这一结论与传统生物化学相关理论的论述是相符合的。 2.3 优化操作程序的多样本比较实验 本研究设计的操作程序应用于来自不同个体的样本时，DNA产量的差异很显著，在10个样本中，有4个样本的提取物在进行电泳检测时不可见，并且其中的两个样本当以其DNA作为模板进行PCR时也未出现扩增产物。如图6、7所示。 Lane1-2：从样本1中提取的DNA Lane 3-4：从样本2中提取的DNA Lane5-6：从样本3中提取的DNA Lane 7-8：从样本4中提取的DNA Lane 9-10：从样本5中提取的DNA Lane M： MW marker DL 2000 ( 20ng / band ) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 2000bp 图6 对不同样本进行DNA提取的结果 801bp Lane1-2：样本1DNA产物为模板的PCR结果 Lane 3-4：样本2DNA产物为模板的PCR结果 Lane5-6：样本3DNA产物为模板的PCR结果 Lane 7-8：样本4DNA产物为模板的PCR结果 Lane 9-10：样本5DNA产物为模板的PCR结果 Lane M： MW marker DL 2000 ( 20ng / band ) 750bp 1000bp 图7 以不同样本DNA产物为模板进行PCR的结果 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 在图6显示的结果中，样本3-8的DNA浓度大致相等，估测值约为5ng/l左右，随后进行的PCR实验结果中，如图7所示，以样本3-7的DNA为模板进行PCR时各产物量大致相同注，也进一步证明了模板DNA数量的近似相等。对于样本1和2来说，虽然它们的DNA提取物在电泳检测中不可见，但用作模板进行PCR时却同样可以获得目的产物，尽管产量明显小的多。而样品9和10则不同，不仅检测不出所提取的DNA，而且以提取物为模板进行PCR时也没有获得产物，说明DNA提取是完全失败的。究其原因，应该是个体发质情况的特殊导致无效取样而造成的。 在本研究中，对操作程序进行的优化工作主要注重于DNA提取效率的提高，而对于DNA的产量和质量，则以能满足后续检测工作的需要为原则。从本实验的结果来看，在正常情况下，按照优化程序进行DNA提取时，虽然所提取DNA的产量不能达到最高，但却能很好的满足后续的PCR程序的要求。 3. 讨论 3.1 头发样品的质量以及取样方法对DNA产量的影响 一般来说，在人的不同个体之间，虽然头发长短、发质类型等有所区别，但生长头发部位的皮肤组织结构及其厚度应该差别不大，因此取自不同个体的头发其根部都有明显可见的毛囊组织，这就为DNA提取提供了足够的材料，本研究中对来自不同个体的头发的比较研究结果也证明了这一点。 但在实际操作中，各样品的DNA产量也有这非常明显的差别，其影响因素主要有三：（1）拔取头发时的手法和动作对所获得的毛囊组织的大小影响很大；（2）不同粗细的毛发其毛囊大小差别较大；（3）操作者有时将头发在离心管中倒置而没有发现，使得毛囊组织没有浸泡在消化液中，造成DNA释放效率的降低。因此，选取头发、拔取头发时的细节动作和样品在离心管中的放置方式都很值得注意。 通过观察和对比，我们认为取样的操作要点如下：（1）选取头枕部的粗硬头发作为样品，尽量不选取细软的头发；（2）拔取头发的动作要点在于：a、一定要用镊子，不要用手指捏，这样可避免滑脱；b、要夹住头发根部，而一定不能夹住头发尾部，这样可避免头发从根部断开；c、要顺着头发生长方向拔，最好不要直向上方拔，更不能逆着头发生长方向拔，其目的也是为了避免头发从根部断开；d、对于清洁的头发和油腻的头发来说，拔取前者时更容易获得完整的毛囊组织，同时所提取的DNA纯度也相对较高，因此拔取头发之前最好先将头发洗干净。（3）将样品放入离心管时，要注意将头发根部的毛囊组织接触到管底，要避免毛囊接触管壁而沾在上面。 3.2  适用于婴幼儿的取样方法 本研究中所使用的样品均取自成年人，对于新生儿、婴儿和儿童则没有进行相应的研究。我们对此进行的理论分析结果认为，虽然不同年龄个体在这两种组织取样的结果上会有所差异，如新生儿和婴儿的毛囊组织太少等，但只需简单地增加取样量，即可保证所提取的组织DNA的产量足够检测项目的后续步骤使用。 4. 结论 综合上述实验现象和分析讨论的结果，本研究提出以头发为材料进行DNA提取的操作程序如下： 1、 取样：选取头后枕部的较粗硬头发一根，用镊子夹住其根部，顺着头发生长方向迅速拔下，用剪刀尽量剪去头发的毛干部分，将剩下的毛根部分放入1.5ml离心管中，使其毛囊部沾在离心管底部。 2、 DNA提取：操作步骤如下： （1） 入60l消化液，再加入1l蛋白酶K溶液，用涡旋混合器震荡5秒钟。 （2） 于55℃水浴10分钟。 （3） 加入60l LiCl溶液，用涡旋混合器震荡5秒钟，冰浴10分钟。 （4） 用微量离心机以最高速离心10分钟，将上清移入一个新的离心管中。 （5） 加入240l无水乙醇，颠倒混匀后室温放置10分钟。 （6） 用微量离心机以最高速离心10分钟，弃上清，用70％乙醇将沉淀洗一次。 （7） 13 000rpm离心5分钟，弃上清，并将残留乙醇吸干净，室温干燥20分钟。 （8） 加入20l TE缓冲液溶解DNA。 （9） 用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。 参考文献 1、 F.奥斯伯等著；颜子颖等译，《 精编分子生物学实验指南》科学出版社，1998年版 2、 卢圣栋主编，《现代分子生物学实验技术》，中国协和医科大学出版社，1999年12月版 3、 吴冠芸等主编，《生物化学与分子生物学实验常用数据手册》，科学出版社，1999年版