【doc】根癌农杆菌法转化康乃馨的条件探索

【doc】根癌农杆菌法转化康乃馨的条件探索 根癌农杆菌法转化康乃馨的条件探索 安徽农业科学,JournalofAnhuiggfi.Sei.2008.36(13):5329—5330责任编辑庆珞责任 校对卢瑶 根癌农杆菌法转化康乃馨的条件探索 丁小维,刘开辉,邓百万,陈文强,刘飞虎2 (1.陕西理3-学院,陕西省资源生物重点实验室,陕西汉中723001;2.云南大学生命 科学学院,云南昆明650091) 摘要『目的]为构建高效的康乃馨遗传转化体系奠定基础.[方法]以康乃馨叶片为 受体材料,通过抗G418筛选,探讨预培养时间,根 癌农杆菌茵液浓度,共培养时间等因素对根癌农杆菌介导康乃馨遗传转化的影 响.[结果]20rnlCA18是康乃馨叶片转化的适宜浓 度.随着预培养时间的增加,康乃馨叶片的存活率降低,预培养2,3d时抗性芽分化 率较高.当根癌农杆菌I锄为0.5,0.8时,抗性 芽分化率较高,适合康乃馨转化.共培养2,3d时,康乃馨叶片生长状态好,抗性芽 分化率最高.[结论]预培养,共培养各2,3d,茵液 浓度为0.5,0.8是根癌农杆菌介导康乃馨遗传转化的适宜条件. 关键词康乃馨;根癌农杆菌;遗传转化 中图分类号$682.162文献标识码A文章编号0517—6611(2008)13—05329—02 ExplorationontheGeneticlt'ansformationConditionsofD/anthuscaryophyt/usL.Mediate dbyAgrobacter/tununneSac/ens GXiaa-weietal(ShaanxiKey1.abomtoryofBio-res0lJI? es,ShaanxiUniversityofTechnology,Hanzhong,Shaanxi7230o1) AIIstraetlObjective]researchaimedtolaythefoundationforconstructingthehighly-efficie ntgenetictransforrmtionsystemofD/wah~caryophyl- L-lMethodJWiththeleavesofD.caryophyllusasreceptormaterials,theeffectsofsuchfactor sasprecuhuretime,theconen.ofAgrobacterhun aunefaclensandcocuhuretimeonthegenetictransfonmtionofD.caryophyllusmediatedby A.tumefac/enswerestudiedthr0ug}lG418screening.1Re- suhl20mlG4l8wasthesuitableconen.f0r?1etransfommtionofD.caryophyllusleaves.Wi山?1eincreasingofprecuhuretime,?1esurvivalmte 0fD.caryophyllusleaveswerereduced.Whenprecuhuretimewas2, 3d,thedifferentiationrateofresistantbudswerehisher.When‰ofA. tumefac/enswas0.5, 0.8.thedifferentiationmteofresistantbudswerehigherandfavorableforthetransfonmtionof D.caryophyllus.Whencocuhure timeWas2, 3d,thegrowthstateofD.caryophyllusleavesweregoodandthedifferentiationmteofresistant budswerehighest.1ConclusionJBoth precultueandcoculturef0r2,3dandthebacterialliquidconen.‰0f0.5, 0.8werethesuitableconditionsforthegenetictransforr~tionofD. caryophyllusmediatedbyA.aunefac/ens. KeywordsD/anth~caryoph~l/usL.;Agrobactenkuntumefac/ens;Genetictransformation 康乃馨(D/anthuscaryophyllusL.)为石竹科石竹属多年宿 根性草本植物,是世界着名的四大切花之一.是典型的呼吸 跃变型花卉,花期短.通过植物基因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 的方法可以控制其 乙烯生物合成,以达到延长花期的目的.以根癌农杆菌介导 转入康乃馨花瓣,叶片在国内外虽已有报道_1I3J,但转化难 度高,频率低,很难得到正常生长的转基因植株,因此至今未 形成一个有效的康乃馨遗传转化体系.笔者研究影响康乃 馨转化的一些主要因素,为构建一个高效的康乃馨遗传转化 体系奠定基础. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1植物材料.康乃馨材料由云南省农业科学院花卉研 究所提供,品种为俏新娘.康乃馨的顶芽用75%酒精消毒3o s,无菌水冲洗5,6次后,用0.1%升汞溶液消毒6min,无菌 水冲洗5,6次后,接种到附加BA0.3nv,/L和NAA0.1nv,/L 的MS培养基中,于22?,光照12h条件下培养,待无菌苗长 到10cm左右,取其顶端叶片作为转化材料. 1.1.2菌株及质粒.根癌农杆菌菌株为EHA105,所含质粒 上构建有目的基因康乃馨反义ACC氧化酶基因和植物抗性 筛选标记^r?基因. 1.2方法 1.2.1根癌农杆菌的培养与保存.根癌农杆菌培养在含有 25mg/LRif(利福平),25mg/LStr(硫酸链霉素),50mg/LKan (卡拉霉素)的YEP培养基,置一70?冰箱中冷冻,保藏. 1.2.2康乃馨G418敏感性测试.取康乃馨无菌苗顶端第 基金项目 作者简介 收稿日期 陕西省教育厅重点科研项目(03JI,027). 丁小维(1979一),女,陕西成阳人,硕士,讲师,从事生物资 源的保护,开发与利用方面的研究.*通讯作者. 20o8-02.29 2,4片叶接种于MS附加一定浓度G418的固体培养基上, G418浓度分别为0,10,20,40,60,80nv,/ml,每处理接种10瓶, 每瓶3片叶.于22?,光照12h条件下培养,5d观察1次叶 片生长状况. 1.2.3康乃馨叶片在转化前的预处理.取无菌苗顶端第2, 4片叶接种于M.s附加1.0mg/LBA及0.3nv,/LNAA的固体 培养基上分别进行预培养1,2,3,4d,于22?暗培养. 1.2.4根癌农杆菌菌液的制备.从YEP平板上挑取单菌落 接种于液体YEP培养基上(R.if25nv,/L,Str25nv,/L,Kan50 nv,/L),于28oC,200r/min振荡培养过夜,扩大培养至对数生 长期,离心搜集菌体,用MS液体培养基分别稀释制备成 0600为0.5,0.8,1.0的根癌农杆菌菌液. 1.2.5转化与筛选.将预培养过的外植体在根癌农杆菌菌 液中浸泡10min,然后转入共培养基中,共培养时间分别为 1,2,3,4,5d.共培养一定时间后转移到筛选培养基中,筛选 培养基中逐渐加大G418浓度.待分化出的苗长至2,3cm 时,从基部切下转入生根培养基培养并移栽. 2结果与分析 2.1康乃馨G418敏感性鉴定G418浓度为0,10,20,40,6o, ,叶片白化率分别为0,10%,50%,76%,85%, 80me/ml时 98%.由此可见,康乃馨叶片对G418很敏感.在未加G418 选择压的培养基上,叶片白化率为0.当G418为20mg/na 时,50%康乃馨的叶片经过20d的培养慢慢变白.当G418 为60mg/na时,经过20d的培养85%的康乃馨叶片都变白死 亡.因此确定20mg/naG418为转化叶片适宜选择浓度. 2.2植物材料的选择和预培养同一品种,康乃馨材料来 源不同,其对根癌农杆菌感染的耐受力及G418的选择压不 同.若以田间叶片为外植体时,G418的浓度较高,对根癌农 杆菌的耐受力较强;而以组培苗叶片为外植体时,G418浓度 5330安徽农业科学2008盎 较低,对根癌农杆菌的耐受力较弱,可能是组培苗叶片较为 幼嫩.但它们的分化再生能力和生长状态无显着差异. 预培养可以促进细胞分裂,分裂状态的细胞更易整合外 源基因,因而可以提高转化效率.不预培养或预培养时间过 短,外源基因不容易整合进植物细胞,用根癌农杆菌感染后, 转化效率低,容易出现嵌合体.预培养时间过长,外植体伤 口处膨大疏松,且伤口逐渐愈合,难以浸染,康乃馨材料容易 ,随着预培养时间增加,叶片存活率降 玻璃化.从 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1看出 低,预培养2,3d可以得到较高的抗性芽诱导率.因此,预 培养2,3d较为适宜. 表1预培养时间对叶片的影响 卫由Ie1Elfetts0fpre~turetime皿lmvm 2.3根癌农杆菌的培养和稀释根癌农杆菌浓度高,选择 培养时,潜伏的根癌农杆菌容易过度生长,会对叶片造成污 染,导致叶片死亡;浓度太低,转化效率降低.表2表明,当 0.8时,抗性芽分化率均较高,适宜 根癌农杆菌OD6oo为0.5, 于康乃馨转化. 表2农杆菌菌液浓度对叶片的影响 2Elfeets0fA.amlefa,t:ienseonomtmfiomonleaves 2.4植物材料与农杆菌的共培养康乃馨叶片对根癌农杆 菌的耐受力较差,感染时间一般为8,10vain,其后于19,22 ?共培养.康乃馨对温度的要求较严格,若温度超过22? 时,其再生芽玻璃化率明显增加,若温度低于19?,其生长 缓慢. 外植体与根癌农杆菌的共培养是T-DNA转移到植物细 胞的过程,共培养时间的长短影响到T-DNA片段能否成功转 入植物细胞[.由表3看出,相同G418选择压,共培养时间 不同.叶片存活率和抗性芽分化率不同.共培养2,3d时, 叶片生长状态好,其抗性芽分化率最高.随着共培养时间增 加,叶片生长状态较差,存活率降低,其抗性芽分化率降低. 说明共培养时间越长,叶片受到伤害越大,而这种伤害主要 来自根癌农杆菌的过度生长.所以2,3d为康乃馨叶片适 宜的共培养时间. 共培养后,根癌农杆菌的过度生长是一个主要问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 .为 了解决这个问题,共培养采用了2种试验 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 .一是MS固 体培养基进行共培养;二是将MS液体培养基滴入双层滤纸 上进行共培养.试验发现,2种方案各有优缺点.第1种方 案简单,污染可能性低,但芽分化率低,根癌农杆菌很容易过 度生长.第2种方案较烦琐,操作过程中容易造成污染,操 作中若滴入液体太多,玻璃化严重,芽分化率降低,但芽分化 能力较强,根癌农杆菌生长容易控制住. 表3共培养时间对康乃馨转化的影响 3Elfetts0feoculturetime皿transl'orn~0fD.? 3讨论 (1)以康乃馨叶片为受体材料,通过抗G418筛选,探讨 叶片预培养,根癌农杆菌浸染,共培养时间等因素对根癌农 杆菌介导康乃馨遗传转化的影响.许多试验研究结果表 明_4J,菌液浓度和浸染时间,预培养时间,共培养时间对转 化都有一定的影响,尽管所试材料和菌株不同,但获得的一 般结果是:预培养2,3d,共培养3,4d,菌液浓度OD6oo 0.5,1.0,浸染时间15,20nfin.而试验结果与此有所不同, 共培养时间2,3d,菌液浓度OD6ooO.5,0.8,浸染时间8,10 min,这可能是由于不同的受体材料对菌液耐受力不同. (2)选择适宜的能抑制根癌农杆菌生长的抗生素是保证 转化成功的一个前提.不同植物所用抑菌抗生素种类和浓 度不同.Car和Cef是常用的抑菌抗生素.试验使用400 t,e,/mlCef,与转化枳壳_6J所用抑菌抗生素种类一致,但浓度 不同. (3)康乃馨叶片容易玻璃化,叶失绿,变厚,呈半透明状 态.根癌农杆菌感染的叶片较对照玻璃化严重,这表明根癌 农杆菌也会引起叶片玻璃化,可能是感染过程中,植物细胞 和组织的生理机能受到损伤所致.试验使用透气膜,适当降 低培养温度,改变共培养方法等 措施 《全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观软件质量保证措施下载工地伤害及预防措施下载关于贯彻落实的具体措施 ,明显减少了玻璃化 现象. 参考文献 [1]VANALVOSrAC,KOHORSrH,JONGJ,da1.旺cca~(31-1plants obtainedbyAg【曲日cImrdiat.dtransfca,'matian0fpdexplants[J].Plant Cell,~ssueandO,s~nCulture,1996,169:169一l73. [2]VANALVOSI"AC,R/KSENT,KOHORSrH,e【a1.Shootr~(31-1and ADbum-meidiat.dIransfca'~0fcam锄[J].ActaI'larticolture; 1995.420:92—94. [3]张树珍,汤火龙,杨本鸱,等.康乃馨ACC氧化酶反义基因遗传转化康 乃馨的研究[J].园艺,2O(/3,30(6):699—702. [4]王关林,方宏筠.植物基因工程[M].2版.北京:科学出版社,2[112:393. [5]周春丽,郭卫东,路梅,等.农杆菌介导佛手遗传转化主要影响因素的 研究[J].热带亚热带植物,2O06,14(5):374—381. [6]贺红,潘瑞炽,韩美丽,等.根癌农杆菌介导的枳壳遗传转化的研究 [J].云南植物研究,1998,20(4):1—4.