心房钠尿肽对肺泡Ⅱ型上皮细胞的保护作用

心房钠尿肽对肺泡Ⅱ型上皮细胞的保护作用 心房钠尿肽对肺泡?型上皮细胞的保护作 用 志ChineseJournalof2O0r7.23(6):llll—lll5 [文章编号】1000—4718(2007)06—1111—05 心房钠尿肽对肺泡?型上皮细胞的保护作用 闫志强件,魏敏,李志超,李志斌',刘毅', 张博',张齐',彭利静',罗颖' (第四军医大学病理生理学教研室,陕西西安710032;新疆军区克州军分区卫生所,新疆阿图什845350) [摘要】目的:探讨心房钠尿肽(ANP)对脂多糖(LPS)引起肺泡?型上皮细胞(AT—II)损伤的治疗作用. 方法:分离培养AT一?,以LPS复制大鼠AT一?损伤模型,分别给予l0-?,l0,,10mol/L等不同剂量的ANP进 行治疗,通过观察4h,12h,24h等时点细胞培养上清液中LDH,MDA,AKP,总磷脂(rPL)水平及细胞培养上清液 的表面张力(sT)变化,研究ANP对LPS引起的AT一?损伤的治疗作用.结果:在不同剂量,不同时点条件下,各 ANP组细胞培养上清液LDH,AKP活性及MDA含量均明显低于LPS组,呈明显的剂量依赖性和时间依赖性,以高 剂量组(10)和12h时点疗效最佳.以12h时点为例,细胞培养上清液中AKP活性为:control(43.5?10.4)U/ L,LPS(98.1?16.4)U/L,LPS+ANP(10一')(46.4.4-10.5)U/L,LPS+ANP(10一)(60.7?9.5)U/L,LPS+ANP (10)(91.3.4-13.9)U/L.LPS组细胞培养上清液中rPL含量明显低于对照组,ST水平明显高于对照组,不同剂 量,不同时点的各ANP组细胞培养上清液中TPL含量均不同程度地高于对应的LPS组,各ANP组细胞培养上清液 中的sT水平均低于对应的LPS组.结论:ANP可显着减轻LPS引起的AT—II损 伤,促进肺表面活性物质(PS)的 合成,分泌,且该作用有明显的剂量依赖性和时间依赖性. [关键词】心钠素;呼吸窘迫综合征;肺泡 [中图分类号】IL563.1[文献标识码】A Protectiveeffectofatrialnatriureticpeptideonalveolarty'peHcells YANZhi—qiang,WEIMin,LIZhi—chao,LIZhi—bin,UUYi,ZHANGBo, ZHANGQi,PENGU—jing,LUOYing (Depamnemof砌.Il9 岫,SchoolofBasicMedicine,FourthMUa~yMedical,Xian710032,China; ,nofKezhouJI,订Subregionin~njiang,Atushi845350,China.E— mail:lizhic@fmmu.edu.c,I) [ABSTRACT]AIM.-Tostudytheprotectiveeffectofatrialnatriureticpeptide(ANP)onalve ol~typeIIcells (AT一?)damagedbylipopolysaccharide(LPS).METHODS:AT— I1wereplacedina6wellcellculturecluster(0.5× 10cells/cm2)anddividedinto3groups:(1)controlgroup(,I=6),the~diulnconsistedofRPMI 一1640withoutFBS. (2)LPSgroup(,I=6),themediumconsistedofRPMI一 1640withoutFBSsupplementedwithLPS(1ms/L).(3)ANP group(,I=6),themediumconsistedofRPMI一 1640withoutFBSsupplementedwithLPS(1ms/L)andANP(10一. lO一,10一 mol/L).After4,12and24h,thecellculturemediumsofcontrolgroup,LPSgroupandANP(10 一mol/L) groupwerecollected,andthoseoftheANP(10一,10一 moVL)groupwerecollectedafter12h.Alkalinephosphatase (AKP),lactatedehydrogenase(LDH),malondialdehyde(MDA),totalphospholipids(TPL) andsurfacetension(ST)in themediumofeverygroupwereexamined.RESULTS:AT— I1werecharacterizedbyAKPstaining.Thecontentsof LDH,AKPandMDAinthemediumofeveryANPgroupwerelowerthanthoseinthecorrespondingLPSgroup.TheTPL contentinthemediumofeveryANPgroupwB8higherthanthatinthecorrespondingLPSgroup,andthechangeofSTof themediumwB8oppositetothatofTPL.Theeffectat12hw88themostsignificant,forexample,at12h.theactivitiesof AKPinthemediumswere:control(43.5?10.4)U/L,LPS(98.I?16.4)U/L,LPS+ANP(10 一)(46.4.4-10.5) U/L,LPS+ANP(10)(60.7.4-9.5)U/L,LPS+ANP(10)(91.3.4-13.9)U/L.CONCLUSION:ANPprotects theAT—IIfrombeingdamagedbyLPSandpromotesthesecretionofpulmonarysurfactants. [KEYWORDS]Atrialnatriureticfactor;Respiratorydistresssyndrome;Pulmonaryalveoli [收稿日期】2005—09—22[修回日期】2005—12—19 撑现在新疆乌鲁木齐市兰州军区乌鲁木齐总医院,830000 ?通讯作者Tel:029—84774548;E—mail:lizhic@fmmu.edu.ca 急性呼吸窘迫综合征(acuterespiratorydistress syndrome.ARDS)是指由各种肺内外致病因素所导 致的急性,进行性呼吸衰竭,是急性肺损伤的严重阶 段,是常见且难治的临床急性危重症,发病机制复 杂,治疗方法有限,死亡率高达50%.到目前为止, 仍然没有特效治疗措施,近年来出现了一些新疗法, 但治疗效果仍不理想,死亡率仍较高.肺泡?型上 皮细胞(alveolartypeIIcells,AT一?)对于维持肺 功能具有重要作用,该细胞损伤是ARDS发病过程 中的重要环节之一.本室以往的研究已证明心房钠 尿肽(atrialnatriureticpeptide,ANP)对ARDS有治疗 作用,且该治疗作用可能与ANP保护AT一?有 关_1J.本实验拟利用脂多糖(1ipopolysaccharide, LPS)复制的体外培养AT一?损伤模型,进一步探讨 ANP对AT一?的保护作用. 材料和方法 1材料 雄性SD大鼠,体重200—220g,第四军医大学 实验动物中心提供;RPMI一1640培养基购自美国 Gibco公司;胎牛血清购自杭州四季青生物公司; DNaseI购自华美公司;ANP,LPS,胰蛋白酶,Hepes 及EGTA均购自美国Sigma公司;大鼠IgG,DAB及 BCIP/NBT显色浓缩液购自北京中山生物技术公司; sP—A多克隆抗体,SABC试剂盒均购自武汉博士德 公司;乳酸脱氢酶(LDH),碱性磷酸酶(AKP),丙二 醛(MDA)试剂盒为南京建成生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 研究所生产; 磷 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 溶液为第四军医大学预防系高双斌高级实验 师惠赠;CO恒温孵箱为德国Kendro公司生产;倒置 显微镜为Olympus公司生产;725一C型紫外可见分 光光度计为上海第三分析仪器厂生产;电子显微镜 为日本电子株式会社生产;其它试剂为国产分析纯. 2方法 2.1AT一?的分离,纯化,培养,鉴定及衰变观察 参照Dobbs等介绍的方法,略有改动.大鼠称 重,腹腔内注射肝素(1X10U/L)4mL/kg和乌拉坦 (200g/L)5mL/kg,无菌条件下腹主动脉放血,开 胸,用?液[mmol/L:NaCI140,KCI5,Hepes10, CaCI22,MgSO41.3,PBS(pH7.4)2.5]经肺动脉冲 洗肺内血,同时经气管插管进行手动通气,直至肺变 苍白.取出心肺进行肺泡灌洗,I液[mmol/L:NaCI 140,KCI5,Hepes10,glucose6,EGTA0.2,PBS(pH 7.4)2.5]8次,每次10mL,II液2次,每次10mL, 37?预热的胰蛋白酶1次(10mL).经气管注入 37?预热的25g/L的胰酶消化液20mL,37?水浴 消化20min,每隔5min补充胰酶5mL.消化完毕, 切除大气道,肺门及大血管等,加入5mL血清,4mL DNaseI,将肺组织剪成约1mmx1mmx1mm小 块,每分钟130次,振荡3—5min,120目,200目不锈 钢滤网逐级过滤,1000r/mim离心8min.用不含 血清的RPMI一1640培养液重悬细胞并计数,调浓度 至2X10cells/L,接种于包被大鼠IgG的细菌培养 皿(直径90mm)10mL/皿.37oC,5%CO2,95%空 气条件下孵育1h,移出上清液中未黏附细胞,离心 收集细胞,台盼蓝排斥试验证实活细胞率大于93%. 用含15%胎牛血清的RPMI一1640培养液重悬细胞 并计数,调浓度至1X10cells/L,接种于培养板0.5 X10ceHs/cm.37oC,5%CO2,95%空气条件下孵 育培养,24h换液,弃未贴壁细胞,贴壁细胞即为分 离,纯化的AT—II.AKP染色,胞浆内可见深蓝色 的阳性反应产物.sP—A免疫细胞化学染色,胞浆 内可见橙黄色阳性反应产物.电镜下可见板层小体 结构.综合上述3种鉴定方法,阳性细胞率大于 88%.通过光镜观察及AKP染色证实,AT一?在培 养60h内无明显衰变,36—60h适合实验. 2.2观察指标 ?细胞培养上清液总磷脂(totalphospholipids,TPL) 的测定采用Bartlett法略有改动.细胞培养上清 液中加入2倍体积的氯仿一甲醇(2:1,v/v)萃取 液,振荡1min,2500r/min离心10min,弃上层液体 但不弃界面杂质.加入1/4体积的甲醇一水(1:1, wv)萃取液,振荡1min,2500r/mim离心10rain. 弃去上层液及界面杂质,氮气吹干,即得到磷脂, 一 20?保存待测.将磷脂加入1mL高氯酸加热, 温度由低到高逐渐上升,直至颜色由黑变白,表示磷 脂完全氧化,继续加热蒸干高氯酸.磷钼蓝比色法 测定样本中无机磷含量.根据磷脂中磷含量约为 0.04,算出磷脂含量. ?细胞培养上清液表面张力(surfacetension,ST)的 测定将毛细玻璃管垂直插入到细胞培养上清液 中,测量毛细管内外液面高度差,根据拉普拉斯方程 =rpg(h+r/3)/2计算出细胞培养上清液的sT,以 此来反映肺泡表面活性物质(pulmonarysurfactants, PS)的功能.其中,为表面张力(单位为mN/m),r 为毛细管半径,P为液体密度,g为重力加速度,h为 内外液面高度差. ?细胞培养上清液中LDH,AKP,MDA水平的测定 按试剂盒说明书操作. 2.3实验分组调制浓度为1X10cells/L的细胞 悬液,常规接种于6孔培养板,培养36h后按下述分 组:?control组(n=6)每孔加入2.5mL无血清 RPMI一1640,分别在4,12,24h收集样品.?LPS 组(n=6)每孔加入含us(1m#L)的无血清RPMI 一 16402.5mL,分别在4,12,24h收集样品.? ANP组(rt=6)每孔加入2.5mL无血清RPMI一 1640,其中含LPS1mg/L,ANP含量分别为10,, 10,,10,moL/L.ANP(10.)组分别在4,12,24h 收集样品,ANP(10)组及ANP(10)组于12h收 集样品. 3统计学处理 实验数据均以?s表示,用SPSS统计软件进 行统计学分析,组间差别以完全随机设计资料的方 差分析处理. 结果 1ANP对AT一?的保护作用 在不同剂量,不同时点条件下,各ANP组细胞培 养上清液LDH,AKP活性及MDA含量均低于LPs 组.在10,一10moL/L范围内ANP作用呈明显的 剂量依赖性,以高剂量组(10mol/L)效果最佳,3 项指标均达正常水平;以低剂量组(10mol/L)效果 最差,3项指标与LPs组无显着差异.我们以LPs组 和ANP组的差值作为判断ANP疗效的指标,结果显 示3项指标均以12h时点疗效最佳(图1—6). ,一 Z 凸 Time(h) Fig1ThechangeofLDHindifferentgroups.'P<0.05ff$ control:P<0.05ff$U)S. 图1各组LDH水平的变化 400 舌300 200 100 ControlLPSL十A(1OL+A(1)L+A(104) Group Fig2ThechangeofLDHindifferentgroups.'P<0.05ff$ control:P<0.05ff$LPS;P<0.05ff$theprevigus dosegroupoftheANPgroup. 图2各组LDIt水平的变化 Time(h) Fig3ThechangeofAKPindifferentgroups.P<0.05ff$ control:P<0.05ff$U)S. 图3各组AKP水平的变化 l20 l00 80 60 40 20C ontrolLPSL十A(104)L+A(10)L+A(1B) Group Fig4ThechangeofAKPindifferentgroups.P<0.05ff$ control;P<0.05ff$LPS;P, <0.05ff$theprevious dosegroupsoftheANPgroup. 图4各组AKP水平的变化 Time(h) Fig5ThechangeofMDAindifferentgroups.P<0.05ff$ control:P<0.05ff$U)S. 图5各组MDA水平的变化 2ANP促进AT—lI合成,分泌PS的作用 与control组比较,LPs组细胞培养上清液中11PL 含量明显降低,sT水平显着升高.在不同剂量,不同 时点条件下,各ANP组细胞培养上清液中11PL含量均 一1/f1一《一1/f1)《一1/一0gg)《口 高于LPS组,各ANP组细胞培养上清液ST均低于 LPS组,在l0一一10mol/L范围内有剂量依赖性,4, l2,24h3个时点以12h疗效最佳(图7—10). Group Fig6ThechangeofMDAindifferentgroups.'P<0.05 control;P<0.05LPS;P<0.05theprevious dosegroupsoftheANPgroup. 圈6各组MDA水平的变化 曼 Fig7Thechangeof11PLindifferentgroups.'P<0.05con. trol;_P<O.05LPS. 圈7各组TPL水平的变化 邑 富 Group Fig8Thechangeof11PLindifferentgroups.'P<0.05con. trol;P<O.05U)S:P<0.05thepreviousdose groupsoftheANPgroup. 圈8各组TPL水平的变化 4812162024 Time(h) Fig9ThechangeofSTindifferentgroups.'P<0.05con- trol;P<O.05LPS. 圈9各组ST水平的变化 Group Fig10ThechangeofSTindifferentgroups.'P<0.05con- trol;P<0.05LPS;P<O.05thepreviousdose groupsoftheANPgroup. 圈1O各组ST水平的变化 讨论 多年来ARDS一直是科研工作者关注的焦点, 现已明确革兰阴性菌感染,LPS血症是其主要致病原 因之一.LPS引起AT一?损伤以及PS含量减少或 功能减弱,导致肺泡表面张力增加,引起肺不张,加 重ARDS.可见AT—II损伤及PS异常既是肺损伤 的结果,又是进一步加重肺损伤的基础,是ARDS发 病中的重要环节之一.郑闵琴等l4证实给大鼠注射 LPS后AT一?出现不同程度的退变或崩解,AT一? 内板层小体减少,肺内PS含量及活性下降.Li等] 利用体外培养的AT一?证实LPS可以明显抑制AT 一 ?合成PS.近年来ANP对ARDS的疗效已经明 确,但机制不清.Tharaux等证实AT一?表面存 在ANP受体.Irwin等发现阻断ANP可加重LPS 予处理的大鼠高原性肺水肿.本室先后证实:静脉 注射ANP可使油酸或LPS性ARDS动物血及肺泡灌 洗液中炎性因子含量明显下降,肺湿/干质量比显着 降低,动脉氧分压升高,肺组织结构损伤明显减轻; 加 ^暑\Z暑一? 765432 ^1/10暑暑一《Q 加 一暑\Z暑一? ANP可减轻LPS引起的肺微血管内皮细胞损 伤.本室于2004年已通过整体动物实验证实 ANP可明显减轻LPS引起的急性肺损伤,且该治疗 作用可能与ANP保护AT—lI并促进其合成,分泌 PS有关. LDH是胞内酶,细胞变性,损伤时LDH释放到 胞外,使细胞培养上清液中LDH活性升高,目前已 成为公认的反映细胞损伤的指标.AKP是AT一? 的特异性分化标志,AT—lI变性,坏死时胞内的AKP 进入细胞培养上清液.因此,细胞培养上清液中 AKP活性强弱可以特异性反映AT—lI损伤程度. MDA是脂质过氧化反应的代谢产物,测定其含量可 反映机体脂质过氧化的程度,间接反应细胞损伤的 机制.磷脂是PS的主要成分,占其质量的80%,所 以测定细胞培养上清液中rrPL能间接反映PS含量 变化.因此,细胞培养上清液中TPL能反映AT—lI 合成,分泌PS的功能.PS由AT—lI合成,分泌,在 降低肺泡表面张力,调节肺部免疫功能等方面起着 重要作用,是ARDS病理生理过程中至关重要的环 节之一.PS的主要功能之一是降低气液界面表面张 力,细胞培养上清液sT反映PS降低表面张力的功 能,sT是PS质和量的综合体现,间接反映AT—II合 成,分泌PS的功能.本实验中LDH,AKP及MDA水 平变化说明ANP可明显减轻LPS引起的AT—lI损 伤,其疗效有明显的剂量依赖性和时间依赖性,该作 用可能与ANP抑制脂质过氧化有关;rrPL,ST水平的 变化说明LPS可使AT—lI合成,分泌PS功能下降, ANP可促进AT—lI合成,分泌PS,降低表面张力. 为ANP治疗ARDS提供了实验依据,但ANP对AT 一 ?的作用方式尚有待于进一步研究. 【参考文献】 [1]闫志强,李志超,李志斌,等.心房钠尿肽对急性肺损 伤的治疗作用及其可能机制[J].第四军医大学, 2004,25(23):2199—2201. [2]DobbsLG.GonzalezR,WilliamsMC.Animproved methodforisdmingtypeIIcellsinhighyieldandpufi~ [J].AmRevRespirDis,1986,134(1):141—145. 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