葡萄DNA提取与纯化方法的比较研究

葡萄DNA提取与纯化方法的比较研究 第4誊第2期石河于大学I自捕科学版)Vo1.4No.2 2OO0年6月Jom’na]Shlhe~4I埘衄fNItu哪scle眦)Jim.2OOO fr7—2葡萄聊提取与纯化方法的比较研究 赵怀宝冯建荣蒋迪军刘怀锋樊新民 ,————,————, (1新疆奎屯市园林研究所.奎屯833200;2石河子大学农学院园艺园林工程系,石河子 ;/D/ 一.哆 摄善以巨峰葡萄叶片为试材,在CTAB法,SDS法及高盐低p}I法基础上加以改进,应用5种方法 对葡萄DNA提取,纯化方法进行了比较研究结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明,高盐低pHi去和区室化提取法是2种适合于葡 萄属植物DNA提取的方法.这2种方法提取的DNA纯度高.凝胶电泳显示无明显降解现象.能被限制 性内切酪酶切.适宜作为PCP,模板应用,并成功地进行了扩增.还对影响葡萄等富含多酌,多糖等物质 的多年生果树DNA提纯的有关因索,Me及PVP的抗氧化作用等问题进行了探讨. 美鹫诃 . 里里.銎堡查羹比较研究屯化B琵,S5j 中圈分类号s663.I;,V~03.6文献标识码文章编号 7383l2OO0l02—0117—05 1007— 制各能被限制性内切酶完全酶解并可用柞PcR模板的基因组DNA.是开展果树分子 研究的基础.目前关于植物DNA的提取有许多方法_I』,主要的有:CTAB法_2’,SDS 法.]及高盐低pH法_6】等.通过这些方法已成功地提纯了许多植物的DNA.但对于葡 萄等多糖,脂质,色素和多酚等物质含量较高的物种来说,DNA的制备,纯化就更为困难 一 些.许多研究者发现,RAPD技术并非理论上所想象的那样”简便易行”.一些植物,如 兰花,葡萄体内的特殊内含物和次生产物(如单宁,脂质,多酚及色素类物质)直接影响 Taq酶的活性,导致扩增失败.因此.针对富含多酚,多糖等物质的葡萄多年生果树,找出 适宜的高纯度,太分子量DNA的高教提纯方法就显得十分必要. 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 和方法 1.1试验材料 试验材料取自石河子农科中心葡萄园.供试材料为巨峰葡萄.取材时间为1998年9 月25日(果实成熟至落叶前).材料首先用蒸馏水清洗除去表面污物,用纱布或滤纸吸干 表面残留水分,去掉叶柄,标记分装,置一2O?冰箱冷冻保存备用. 1.2试剂和溶液 1.2.1DNA提取,纯北试剂和溶液十二烷基磺酸钠(SDS),溴酚蓝变色范围:pH3.0 (黄)pH4.6(蓝).8.羟基喹啉,2.琉基乙醇均系进E1分装产品,购自北京天象人生物工 程公司.十六烷基三甲基演化铵(CTAB),聚乙烯吡咯烷酮(PVP),苯酚及其它有关提取, 纯化试剂均系国产 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 纯. 1.2.2DNA酶切试剂限制性内切酶HindIII购自Promega公司. 1.2.3RAPD分析试剂舍M10x反应缓冲溶液,Taq酶稀释液均为随毛细管PCR仪 收稿日期:1999.0~-09 ll8石河子太学(自然科学版)第4卷 配带产品.Ficoll4OO,dNTPmixSolutionKit,BSA,EB等均购自北京天象人生物工程公司. 电泳用s,HBO3,EDTA等均为国产分析纯.随机引物采用美国Operon生物技术公司生 产的l0碱基随机引物 {RandomPrimerDR0097.120gPromegaCI18010nt},购自北京天象 人生物工程公司.所用引物OPJ.16序列为CTGCTrAGGG.Taq酶购自Promega公司. 1.3方法 1.3.1DNA提取方法 方法l:SDS.氯仿.异戊醇法.参照文献l中 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 ?,改进之处有两点,1)在原方案I 中研磨及冲洗时共加入50mol/L的EDTA溶液5mL,转入10ml离心管,2500r/min离心 5rain后,弃上清液.2)把原方案中6—10删除,改为加入5mL氯仿/异戊醇/乙醇(80:4: l6)溶液,颠倒混匀,室温下5000r/rain离心5min,然后接原方案中的l1—13步. 方法2:CTAB.氯仿.异戊醇法.参照文献l中方案?,删除原方案中的9—12步. 方法3:SDS.酚.氯仿.异戊醇法.具体步骤参照文献l中方案?,删除l0,13步,并把 叶样量改为lg,使用的药剂按比例减少. 方法4:高盐低DH法具体步骤参照文献l中方案?,删除步骤3,l0, l3. 方法5:区室化提取法.具体步骤参照文献l中方案?,改进步骤有2处,1)在原步骤 2中加入的样品提取液成分中加入0.4mol/L葡萄糖,3%可溶性PVP,去除蛋白酶K.2) 原步骤3改为离心后弃上清液,加入65?预热的裂解缓冲液(100mol/LTfis.CI,pH8.0,20 mmol/LEDTA,0.5mol/LNaCl,1.5%SDS)悬浮沉淀,在65?水浴中温育45min,不时轻轻摇 动.其后同方法1中的4及以后步骤. 1.3.2DNA的纯化方法参照文献1中方案?的9,12各步进行纯化. 1.3.3DNA的检测 , 1.3.3.1纯度与浓度的测算采用分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法检测. 1.3.3.2DNA的限制性内切酶酶切加限制性内切酶Hindm(10u/vL)0.5, 终体积 20,37?水浴2h后,1%琼脂糖凝胶电泳,染色,紫外检测,照拍. 1.3.3.3PCR扩增所用引物OPJ.16序列为CTGCTrAGGG.RAPD—PCR,反应仪器为 IdoholS18型气浴式毛细管PCR仪.扩增反应总体积l0,反应液组成参照PCR仪使用 说明书.RAPD—PcR反应程序为:1)预变性94?l0s;退火42?8s;72? 延伸608.共2 个循环.2)变性94?0s;42?复性8S;72?延伸60s,循环加周,3)72?下延伸3min. 待样品降至室温后,再在4?冰箱中放置4min,之后,在以0.5×TBE配好的2%凝胶上电 泳,为方便起见,预先在凝胶中加入EB,以4.5V/cm电压,10omA电场强度下电泳,待指 示剂Ficoll跑至凝胶上边缘后,停止电泳,置在304nm的紫外灯下观察,数码机相拍照,并 用KODAK.1DAnalysisSystem自动判读谱带统计分析. 2结果与分析 2.1葡萄DNA提取,纯化方法的比较研究 2.1.15种方法提取的DNA质量比较 5种方法提取的DNA溶解物颜色,纯度见表1. 第2期赵怀宝等:葡萄DNA提取与纯化方法的比较研究ll9 表1不同方法纯化前后DNA质量比较 5种方法提取的DNA电泳图谱见图1(编号1,5分别代表方法15,图2,图3编号同 图1).电泳结果表明,方法1,2,3提取的DNA有拖尾,说明有明显的降解现象,DNA完整 性已受到破坏,而方法4,5提取的DNA较为完整. 5种方法提取的DNA酶切比较见图2.Hind.[II酶切结果表明,方法1,2提取的DNA 未能被酶切,而方法3,4,5提取的DNA能被酶切,达到了进一步分子研究的要求. 5种方法提取的DNAPCR扩增比较见图3电泳结果表明,方法1,2,3提取的DNA 未能扩增,而方法4,5提取的DNA得到了明显的扩增谱带,而且谱带一致,这也说明DNA 提取方法对RAPD带型投有影响. 围15种方法提取 的DNA电涑图谱 围25种方法提取的DNA 酶切图谱 围35种方法提取 的DNAPCR扩增图谱 2.1.25种提取方法的综合比较 通过5种提取方法提取的DNA质量及操作繁简程度等研究发现: 1)使用SDS-氯仿.异戊醇法,CTAB.氯仿.异戊醇法提取的葡萄DNA溶液颜色深,用酚. 氯仿多次抽提,均不能改变这种现象.这可能是由于,在活细胞中细胞分室分工隔离了 DNA与酚类前体物质的缘故,而使用这两种方法提取过程中氧化的 酚类物质与DNA结 合,使DNA溶液颜色变深.而且,电泳后凝胶板上谱带弥散.图1表明,这两种方法得到 的DNA在电泳图谱上都有不同程序的拖尾,说明DNA的完整性受到破坏.这两种方法 l2O石河子大学(自然科学舨)第4卷 制备的DNA不能被限制性内切酶彻底酶切,也不能用于PCR反应(图2.图3).此外.由 于CTAB用量较大.且在CTAB存在下.整个提取过程的温度需保持在15?以上.否则核 酸发生沉淀,丽这不利于有效地抑制核酸酶活性,会影响DNA分子的完整性. 2)使用SDS.酚.氯仿.异戊酵法提取的葡萄DNA溶液颜色较浅,但仍不能被限制性内 切酶彻底水解,也不能用于PCR反应(图2.图3). 3)高盐低pH法,区室化提取法制备的DNA电泳谱带显示片断整齐,无明显的拖尾现 象(图1),说明无降解,可被限制性内切酶彻底酶切.并可用于PCR(图2,图3).特别是高 盐低DH方法.该法具以下特点:(1)在这个方法中所用试剂只是无机盐与异丙酵,要比 CTAB试剂经济得多,低pH能有效地防止组织破碎及沉淀大量材料时的电离化作用和酚 类化合物的褐变.高盐(2.5mmol/LKAy)是有效的蛋白质沉淀剂,比起用氯仿/异戊酵分 层反复抽提去除蛋白,该方法更简便,经济,更广谱.(2)整个实验操作没有特殊的,难以 实现的技术环节和要求.便于研究人员设计和操作,只要有转速达12000r/rain的冷冻离 心机即可.(3)该方法快速简易,操作方便,环节问连接紧凑且有较大的机动性,省时间, 实验安排灵活性大.成本低且效益高.(4)由于操作步骤少.避免了过程繁多而导致的过 多的人为操作误差.提高了DNA提取质量.该法提取的用于PCR扩增的DNA粗提物不 经R_Nose处理,勿须进一步纯化即可有效进行PCR扩增,且扩增效果好.(5)该法提取的 DNA的OD2m/CDmo比值尽管在1.7左右,但完全能用于扩增. 4)区室化提取法建立在常规方法的基础上,利用活细胞中由于细胞区室化,多酚类以 及其它杂质与DNA相互隔离的特性,在裂解细胞核前去除细胞质中大多数生化成分,同 时有效地防止多酚类物质被氧化,从而达到排除多酚类等杂质干扰 的目的.该法也较简 便,操作过程温和,DNA变性降解的机会少.通过调节提取液的渗透势,使之与细胞核内 渗透势保持平衡,防止细胞核破裂,以获取较高的DNA得率.我们认为,提取缓冲液中含 有0.4mol/L葡萄糖较为合适. 3讨论 通过对5种提取方法的综合分析与比较,我们认为影响植物总DNA提取效果的主要 因素有: 1)取材时期.本试验观察到,4,5月植株处于旺盛营养生长早期,此时取材提取的 DNA质量高,也较容易提取.到果实发育的后期,提取就较为困难,DNA提取物颜色重. 这从另一个方面说明叶片内多酚,多糖等物质含量与果实的发育有密切的相关性.考虑 到RAPD分析时的工作量及试验费用,葡萄取材时间以4,8月.在内源贮藏物质较少的 季节里为好.同时,不同提纯方法应视材料生长状况结合考虑而定,并可适当简化提取步 骤.关于葡萄属植物各生长周期体内内含物种类及数量尚需进一步分析研究. 2)丰j料质地.一般嫩的叶片组织易冷冻研磨,老的或术质化程度高的叶片组织不易 研磨.叶片受伤后.其中的多酚类物质会很快地被氧化,因此,在提取前叶片的处理十分 关键.实验中我们采用的山葡萄叶片在室温(约10?)放置0.5h后即全部变为黑褐至 黑色,故应尽可能采用新鲜无损伤的幼叶进行提取.如不得不保存,则样品应贮存在液氮 或一20?冰箱中.另外,应避免重复冻融. 第2期赵怀宝等:葡萄DNA提取与纯化方法的比较研究121 3)在有条件的实验室应尽量用液氮研磨材料.用液氮研磨的植物组织非常细碎,呈 粉末状,而且DNA的收率高.巨峰系许多葡萄的种叶背面都密被绒毛,研磨比较困难,但 在研磨至一定程度后,可将成撮的毛粘状材料剔除. 4)操作准确,及时,迅速.材料在液氯冷冻状态下要迅速研磨,勿让材料融化,而且磨 得越细越好,直至细粉状研磨充分与否直接影响到DNA的产量.所取材料的量也要适 宜,太多定会延长研磨时间和破碎程度,并延长了其在空气中暴露的时间,实验中我们取 0.5一lg叶样即获得足量DNA样品.研磨好的细粉末在转入离心管放人提取缓冲液之 前不要让它融化,要在其化冻前立即加入事先预热的65?的提取介质,振荡以使其充分 混匀,以便及时钝化组织破碎时DNA酶的活性.操作准确,及时,迅速,这点至关重要. 此外,对于高分子量DNA来说,所有操作均需动作轻柔,避免剧烈振荡脱组织蛋白时, 过剧振荡易引起核酸变性,因而影响DNA收率和活性.在用枪头吸取过程中应避免产生 气泡,使用的Tip最好为大13径或是剪掉枪头尖,以免DNA受到剪切或断裂. 参考文献 1傅荣昭,孙勇如,等.植物遗传转化技术手册[M]北京:中国科学技术出版社,1994.131137 2米景九,林书康,等.高分子量植物DNA的快速提取[J].北京农业大学,1990,16(3:580583 3刘学春,潘春欣,等.一种单子叶植物总DNA提取方法的改进及应用[J].山东农业大学,1995,26 (4):491—4495 4刘育乐,米景九玉米,胡萝棱DNA的提取和鉴定[J]北京农业大学,1990.16(3):591—594 5戴思兰,陈俊愉,等.DNA提纯方法对9种菊属植物RAPD的影响[J]. 园艺,1996,23(2):169174 6邹喻苹,枉小全,等.几种濒危植物及其近缘类群总DNA的提取与鉴 定[J].植物,1994,36(7):580 — 586 7DirlewangerEtet.Moleculargeneticmappingof~ach[J].Eupbyli%,1994,77(1—2):101—103 AComparingStudyonMethodsofVitisDNAExtraction ZhaoHuaibao.FengJimlrong:JiangDijun2LiuHuaffeng2 (1InstituteofHarlJ,Kuittm833200;2DeptofHortl&ForestryEn,AcCoil,ShiheziUniv,Shihezi832oo3) AbstractTheresultsof5kindsofimprovedmethodsforextractingvitisDNAwerecompared usingKyohoanddescendantsasmaterials.TheresultsshowthatlowpHextractionmediumand partitionedextractionmethods”wel~eonformabktothequalitystandardO.11lev. NAforPCRpufitof extractedDNAbythesetwomethodswashigIlandtheirfragn~ntw.tlsclearlyshownby0.3% 8~arosegelelectrophomsis.DNAextractedhvthetwomethodswa8suscepti ble1odigestionwith restrictionymeandreadytobeused柏 templatesforPCR.Furthermore.theauthorhasalB0 discussedF:~qmeproblemsinextractionofDNA. Keywordsvitis;DNA;methodsofextraction;comparingstudy