二甲双胍激活腺苷酸活化蛋白激酶途径改善内皮功能研究（可编辑）

二甲双胍激活腺苷酸活化蛋白激酶途径改善内皮功能研究（可编辑） 二甲双胍激活腺苷酸活化蛋白激酶途径改善内皮功能 研究 :. 、 原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研 究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集 体,均已在文中以明确方式标明。本声明的法律 责任 安全质量包保责任状安全管理目标责任状8安全事故责任追究制幼儿园安全责任状占有损害赔偿请求权 由本人承担。 日期.加,『年夕月弓/同 学位做作者像缎 学位论文使用授权声明 本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品,知识产权归属郑州大学。 根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留或向国家有关部 门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅;本人授权郑州 大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索,可以采用影印、 缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用 学 位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时,第一署名单位仍然为郑 卅大学。保密论文在解密后应遵守此规定。 学位论文作者: 日期:?年摘要 二甲双胍激活腺苷酸活化蛋白激酶途径 改善内皮功能的研究 研究生 卫曼曼 导师 鄢文海教授王留义主任医师 郑州大学基础医学院 病理生理学教研室 河南郑州 摘要 内皮功能障碍是动脉粥样硬化,血管并发症的始动环节。 内皮功能障碍与大血管病变的发生、高血压和心力衰竭等心血管疾病有密切关 , 系,其中磷酸腺苷激活的蛋白激酶? 作为一种重要的蛋白激酶参与多种代谢过程,被称为是“细胞能量调节 器”,能感知细胞能量代谢状态的改变,并通过影响细胞物质代谢的多个环节 维持细胞能量供求平衡,在细胞内行使能量代谢调节,从而对内皮功能有重要 作用。活性受/比值调控,被称为细胞的“代谢感受器或调控细 胞和水平的“燃料开关。的长期作用可以调节相关基因的转 录水平.短期作用可以调节各种能量代谢,如增加葡萄糖摄取和糖酵解,刺激 脂肪酸氧化。当体内能量缺乏时,通过/比值调节的活性。例 如在缺氧、低氧和氧化磷酸化受抑制时,肌酸/磷酸肌酸比值与/比值 升高,可以被磷酸化和激活。当机体受到应激或者病理刺激时,可 以影响脂肪酸、糖原与蛋白质的代谢过程,对心血管系统功能调节具有重要 作 用。在心肌及血管平滑肌,缺血、缺氧或心血管活性物质刺激时,的激活 还可以通过影响细胞周期以及物质代谢,从而抑制细胞增殖。因此,在动摘要 脉粥样硬化的预防与治疗过程中具有重要作用。 二甲双胍,是欧洲糖尿病研究协会和美国糖尿 病联合会共同推荐的型糖尿病一线用药被用来治疗糖尿病已经有 余年,其除了具有降糖作用外,还有独立于降糖作用以外的血管保护作用,能 够降低心死亡率和改善慢性心力衰竭的预后【 ,是目前为止唯一一个拥有比 较 坚实的心血管保护作用循证医学证据的降糖药物。因为单一使用二甲双胍可 以 保持体重和减少心血管事件,所以说是肥胖患者与型糖尿病的首选药物。最 近有临床研究发现,二甲双胍不仅能改善糖化血红蛋白和减少型糖 尿病心血管并发症和心力衰竭的预后,还可以通过激活对心血管系统产生 保护作用。但其心血管保护作用的具体分子机制目前尚不完全明确。 实验目的 本实验应用二甲双胍及激活剂作用于经软脂酸: , ,诱导的人脐静脉内皮细胞 , 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 二甲双胍干预前后细胞磷酸化、的蛋白表 达水平,以及培养液中、含量,研究二甲双胍及的激活剂 对人脐静脉内皮细胞磷酸化水平、和含量的影响,探讨二甲 双胍激活改善血管内皮及损伤的内皮功能的可能分子机制,也为有效防 治糖尿病患者的心血管并发症提供新的途径和靶点。 实验方法 .常规培养人脐静脉内皮细胞,并分为六组:?空白对照组常规培养、 , ?二甲双胍,/组、?软脂酸 /组、软脂酸 /甲双胍/组、.氨基咪唑.甲酰胺 核糖核苷酸...,/ / 组、软脂酸 组,经孵育后,收集细胞和培养 上清液。 .采用免疫细胞化学法检测细胞表达.和。 摘要 .采用硝酸豁还原法检测各组培养上清液中的含量。 .采用法测定含量。 .采用 方法检测各组细胞的、蛋白的表达。 .采用.软件进行统计学分析。定量资料用工?表示,多组资料 间的比较采用方差分析,两两比较采用的方法。检验水准.。 实验结果 /相比,软脂酸 .一氧化氮生成量:与空白对照组.?. 组.?. /的培养液中一氧化氮生成减少;与软脂酸组相比, 组.?. /、组.. /的 培养液中一氧化氮生成增加:与空白对照组相比,组.?. /、组.. /的培养液中一氧化氮生成增加,且均 具有统计学意义.。 .一氧化氮合成酶生成量:与空白对照组.. /相比,软脂 酸组.. /的培养液中内皮型一氧化氮合酶生成减少:与软脂酸 / ,组.?. /、组. . 组相比 的培养液中内皮型一氧化氮合酶生成增加;与空白对照组相比,组. ?. /、组.. /的培养液中内皮型一氧化氮合酶 . 生成增加,且均具有统计学意义.。 ..蛋白表达量:与空白对照组相比,软脂酸组的.蛋白表 达量低下;与软脂酸组相比,组、组的.蛋白表达 量增加:与空白对照组相比,组、组的.蛋白表达量增加, 且均具有统计学意义.。 .蛋白表达量:与空白对照组相比,软脂酸组的蛋白表达量低 下;与软脂酸组相比,组、组的蛋白表达量增加;与 空白对照组相比,组、组的蛋白表达量增加,且均具有统计 学意义.。 摘要 结论 二甲双胍能够使人血管内皮细胞激活,增加细胞内一氧化氮合酶和 一氧化氮含量,可能是其改善血管内皮功能及抗血管内皮细胞损伤的机制, 从 而起到抗动脉粥样硬化的作用。 关键词 动脉粥样硬化;二甲双胍;人脐静脉内皮细胞:腺苷酸活化蛋白激酶;一氧化 氮:一氧化氮合酶? , , ., ” ” , ,, , . /’? , ” ” . , ,;/ .. , ~,// , ., , ./, . ., ? . , , , ,. . , . , . . ,,, ,’ , , , , . ., : ,, / , ,./ ./ , /,/ 一???,/ ./ , , , . . .. . . . . .. . . , , 仅.. . . . ./ ./ .. ; , ./,. ./ ? . . /, ; , ./ .. .. . . .“/../ . ; , . .?/, . ./ ; , . ./, . ./ ... . , ,, ; , ,; , , ... . , , , ; , ; , , ...,, ,.; ;; ; ; 目录 目 录 论文部分 . 二甲双胍激活腺苷酸活化蛋白激酶途径改善内皮功能的研究弓 ; 言.??. 青.??. 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法?. 实验结果?. 讨 论结 论参考文献??.. 综述部分 与心血管保护作用参考文献?.. 附录部分 致射?. 个人简介? 英文缩略词表 英文缩略词表 人脐静脉内皮细胞 . 腺苷酸活化蛋白激酶 二甲双胍软脂酸 ...氨基咪唑..甲酰胺 . 核糖核苷酸动脉粥样硬化一氧化氮一氧化氮合酶 心血管疾病 游离脂肪 酸激酶 引言 二甲双胍激活腺苷酸活化蛋白激酶途径 改善内皮功能的研究 研究生 卫曼曼 导师 鄢文海教授王留义主任医师 病理生理学教研室 郑州大学基础医学院 河南郑州 引 言 在工业化国家和发展中国家心血管代谢疾病的患病率达到流行病的发病程 度,并且由于心血管代谢疾病而死亡的人数仍然居高不下【卜。因此,寻求治 疗 和预防心脏疾病的新策略迫在眉睫。在这方面,活化蛋白激酶 通路作为一种治疗心血管代谢疾病的新靶点已成为焦点并受到广泛的关注, 因 为大量的研究证明,至少在某些方面大量的生理和药理作用因素对血管和心 脏 是有益的。有几个重要的代谢,包括增加肌肉葡萄糖摄取【.及改善胰岛 素抵抗【。它调节心肌葡萄糖和脂质代谢的直接或间接地使能量损耗特 别是提高了/的比值。活性也可以被激素和对心血管疾病起保 护作用的脂肪细胞因子调节。已被证明参与调节脂质和糖代谢的基因转 录【?引。这一过程的失调例如肥胖可导致胰岛素抵抗和血脂异常,这两者都 是心血管疾病 ,发病的主要风险因素。因此,确 定特异并且安全的激活途径对治疗、管理甚至预防心血管疾病显得至关 重要。 许多研究表明,在心血管重构等心血管疾病过程中,的活化对心肌 细胞、血管平滑肌细胞和内皮细胞的增殖及代谢都具有重要的作用。首先, 心引言 肌缺血时,的活化可以增加葡萄糖的摄入与糖酵解,从而减少缺血和再 灌注时心肌的损伤和凋亡。在缺失功能的转基因鼠的心脏,轻度缺血再 灌注时,葡萄糖的摄入与糖酵解不能增加,并且左心室的收缩功能恢复明显减 弱,心肌细胞凋亡增加,从而心脏损伤增加。其次,有研究报道,通过抑制 .途径,的活化可以抑制血管紧张素,从而引起的平滑肌细胞 增殖;还能磷酸化,从而激活 //.,使细胞静止于期。此外, 的活化可以促进内皮细胞对游离脂肪酸的氧化,抑制对内 皮细胞的脂毒性,降低胆固醇水平,从而对心血管具有保护作用。的活 化还可抑制高糖刺激的血管内皮细胞中的活性,从而减少内皮细胞的 凋亡。在人血管内皮细胞中,的表达降低可以抑制细胞的迁移和成血管 的能力。相对应的是,等人发现,、激动剂和他汀 类药物激活具有时间和剂量依赖性,并且血管内皮细胞的生成增加。 上述研究提示通路在保护心血管功能中起着重要的作用。 二甲双胍被用来治疗糖尿病已经有余年,并且其能降低死亡率和改善 患者的预后【】。二甲双胍是肥胖患者与型糖尿病患者的首选药物,因为 单一使用二甲双胍可以保持体重的稳定和减少心血管事件【】。近几年临床研究 表明,二甲双胍的作用不仅仅是能改善糖化血红蛋白、减少型糖尿 病心血管病的预后和,还可以通过激活及其下游途径对心血管产生保 护作用。二甲双胍已被证明可激活心肌细胞【~、肝细胞【 】和骨骼肌细胞的 。二甲双胍可以减少肝糖产生和增加骨骼肌葡萄糖清除。有研究证明,治 疗剂量的二甲双胍的. 亚基活性在人体骨骼肌有相关增加,的 磷酸化和活动降低【 。二甲双胍还可以上调一氧化氮合酶并增加 活性【】。此外,二甲双胍可以通过激活提高脂肪酸氧化,从而减轻 内皮脂毒性和改善血管内皮功能【埔】。此外,也有研究证明二甲双胍具有抗癌作 用。近期还有研究证明,二甲双胍通过活性具有抗癌的作用【。目前已 经有一些研究初步探讨了人血管内皮细胞与糖尿病血管并发症之间的关系,但 引言 是有关二甲双胍心血管保护作用的确切的机制仍不甚清楚,有关在二甲双 胍改善血管内皮细胞功能中的作用并没有确切的研究。因此,本实验通过培养 人脐静脉内皮细胞,并对其进行干预分六组后,收集细胞和培养上清液,分别 采用免疫细胞化学法检测细胞表达.和,采用 方法测定各组的磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶和蛋白的表达水平,采用硝酸 盐还原法观察各组培养上清液中的一氧化氮的含量,采用法测定各组 含量。研究二甲双胍及的激活剂对人脐静脉内皮细胞 磷酸化水平、和含量的影响,探讨二甲双胍激活改善 血管内皮及损伤的内皮功能的可能分子机制,也为有效防治糖尿病患者的心血 管并发症提供新的途径和靶点。 材料与方法 材料与方法 实验材料 细胞培养 人脐静脉内皮细胞株由郑州大学干细胞研究中心提供; 主要材料和试剂 胎牛血清 ,上海索莱宝生物科技有限公司 .,公司 青霉素链霉素溶液 ,公司 胰蛋白酶 ,上海索莱宝生物科技有限公司 辣根酶标记山羊抗兔 ,北京中杉金桥生物技术有限公司 兔抗人单克隆抗体 ,北京博奥森生物技术有限公司 预染中谱蛋白分子量 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ,北京赛百盛基因技术有限公司 试剂盒 /,美国公司 免疫组化染色试剂盒 ,北京博奥森生物技术有限公司 一氧化氮测定试剂盒 ,南京市建成生物工程研究所 磷酸化蛋白提取试剂盒 /,南京凯基生物公司 浓缩试剂盒 ,北京中杉金桥生物技术有限公司 蛋白浓度测定试剂盒 ,碧云天生物技术研究所 二甲双胍原粉 .?,公司 软脂酸 ,公司 公司 兔抗人磷酸化抗体 ,公司 兔抗人多克隆抗体 公司 材料与方法 主要仪器设备 医用超净工作台 苏州高新净化工程有限公司/型,法国 恒温培养箱 倒置显微镜 型,日本 ,日本 普通显微镜 , 低温高速离心机 全自动高温高压自动消毒机 一,日本 电热恒温水槽 ,上海森信实验仪器有限公司 ,上海亚荣生化仪器厂 纯水蒸馏器 ,上海跃进医疗器械厂 电热恒温干燥箱 郑州光达空调设备净化公司 细胞培养洁净室百级 ,上海安亭科学仪器厂 低速台式离心机 日本公司 低温冰箱 日本公司 制冰机 蛋白垂直电泳仪和印迹转膜仪 美国公司 酶标仪 ,澳大利亚电子分析天平 一, 紫外可见分光光度计 ,,日本 北京六一医疗器械厂 电泳仪、垂直电泳槽 恒温摇床 ,太仓市科教器材厂 北京六一医疗器械厂 封口机 国产 恒温磁力搅拌器 各种溶液的配置 培养液含%胎牛血清将一培养基微孔滤膜孔 ~ 径.“过滤,分装入灭菌瓶中,保存备用。将一。保存的胎牛血清室 材料与方法 温融化,按体积分数为%的比例加入一培养基中,并按:的比例 加入青霉素链霉素溶液,配成含体积分数为%的灭活胎牛血清培养液。 磷酸盐缓冲溶液:称取氯化钠.、氯化钾.、磷酸氢二钠.、 磷酸二氢钾.倒入装有三蒸水的烧杯中,磁力搅拌器搅拌,充分溶解,然 后把溶液倒入容量瓶中准确定容至混匀,调值至.~.。过滤后 高压消毒,室温保存。 .%胰蛋白酶溶液:称取.胰蛋白酶,加入到缓冲液中,磁力搅 微孔的一次性滤器过滤, 拌器缓慢搅拌,溶解,在无菌操作台上,用. 分装,一?保存。 软脂酸“/:称取.软脂酸,在。水浴中溶解于 ./ 中,再用./ 中和值至.,配成浓度为“/ 的软脂酸溶液,用.胁微孔的一次性滤器过滤,一?保存。 ,加蒸馏 ./: ., ., 水至,调值至.。., ./?: ., ., 加蒸馏水至,调值至.。 %/:丙烯酰胺亚甲基丙烯酰胺.,加双蒸 ,过滤,?保存。 水至 %过硫酸铵: .去离子水溶解后分装,?可保存周。 %浓缩胶:%/ . ../? %过硫酸铵四甲基乙二胺 % ./? %分离胶:%/ 过硫酸铵扯四甲基乙二胺 ×电泳缓冲液: .,甘氨酸., ,加水定容至 。 ×转膜缓冲液: .,甘氨酸., .,加水定容 材料与方法 至,使用时加甲醇。 ,一 .,%甘油,% ×样品缓冲液:/ .,。保存数周,或一。保存 巯基乙醇.,%溴酚蓝., 数月。 缓释液: . .,加双蒸水定容至 ,用盐酸调节至.,高压灭菌,?保存。 %: 加,溶解后。保存。 底物工作液:在底物液中,加入滴约浓缩液 ,充分混匀,即配成工作液。现用现配,避光保存。 × 定影液:三蒸水硫代硫酸钠无水亚硫酸钠冰乙酸 .硼酸.钾明矾 显影液:三蒸水米吐尔.亚硫酸钠.溴化钾.碳酸 钠. 二、实验方法 人脐静脉内皮细胞复苏 从液氮罐中取出装有细胞的冻存管直接投入?水浴锅中,并 轻轻摇动令其内容快速融化; 从水浴锅中取出冻存管,用%乙醇消毒瓶口后开启,用移液管小 心吸出细胞悬液,注入离心管并滴加倍以上.培养液含%胎牛 血清,混合后离心×,弃去上清液; 离心管中加.培养液含%胎牛血清,重悬细胞,接 种至培养瓶中,放入?、%培养箱静置培养,次同更换一次培养液,显 微镜观察细胞生长情况,随后按常规进行细胞培养。 细胞计数 制备细胞悬液: 材料与方法 计数板和盖玻片用%的乙醇擦洗干净后晾干; 把盖玻片覆盖在计数板上,充分混匀细胞悬液,移液管吸取细胞,从计 数板边缘轻轻滴~滴细胞悬液,使之充满计数板和盖玻片之间的空隙中,不 要溢出盖玻片,也不要过少或带气泡,静置半分钟; 在倒置显微镜下用物镜观察,计数四角的个大方格,个以上细 胞组成的细胞团按一个细胞计算,压线的细胞只计上线和左线者。按下列公 式 大格细胞总数/×个/; 计算细胞浓度: 每一样品重复次,取平均值。 免疫细胞化学法检测检测.的表达 .细胞爬片的制备及固定 把大小的盖玻片经防脱片剂多聚赖氨酸处理,高压灭菌, 晾干备用; 把处理好的盖玻片平铺于孔培养板底备用; 取处于对数生长期的细胞,制备细胞悬液; 调整细胞浓度,以约 /的密度接种于含小盖玻片的孔板中, 每孔加液体,放入细胞培养箱中孵育; 待细胞充分贴壁后约.天,轻轻吸出培养板中的培养液,按照实 验 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 分组处理细胞; 实验分组加入培养液继续培养; 小时后,吸出培养板中的培养基,用冲洗次,每次; 加入新鲜配制%多聚甲醛溶液,室温固定细胞; 吸出多聚甲醛溶液,再用冲洗×次; 用镊子夹起细胞爬片,用中性树胶粘于载玻片上有细胞的一面朝 上,放入?冰箱保存备用。 材料与方法 .检测.的表达 严格按照免疫组化试剂盒进行检测,随机挑选制作好的细胞爬片:将封 闭好的爬片用浸泡分钟;% 去离子水无色液体孵育分 钟,以消除内源性过氧化物酶活性: 滴加封闭用正常山羊血清蓝色液体于室温下孵育.分钟,用滤 勿洗: 纸吸去多余血清, 滴加适当比例稀释的一抗:,于湿盒内?孵育.小时或 ?过夜; ×次; 隔日室温复温小时后用冲洗 滴加生物素化二抗工作液/蓝色液体,室温或?孵育冲洗 ×次; 滴加试剂辣根酶标记链霉卵白素工作液.,室温或?孵育 ? 次; 冲洗 显色剂显色:滴加滴新鲜配制的溶液; 显微镜下观察.分钟: 自来水冲洗终止显色反应,苏木素轻度复染,酒精脱水,二甲苯透明, 中性树胶封片,光学显微镜下观察。 .检测的表达 具体步骤详见实验步骤.,其中一抗使用兔抗人抗体:。 .细胞爬片结果判定 阳性细胞判定:光学显微镜下,细胞化学阳性细胞呈棕褐色或者 棕黄块状物质,位于细胞核内。根据年全国免疫组化技术诊断标准化专题 研讨会意见,按阳性细胞数所占比例以及染色深浅对阳性细胞进行积分,进 行 材料与方法 结果判定。 评分标准: 分?阳性物质占细胞面积的比例%,细胞核内可见浅棕褐色,明显高 于背景底色。 分?阳性物质占细胞面积的比例为%.%,细胞核内可见较深棕褐 色。 分?阳性物质占细胞面积的比例%,细胞核内可见大量深棕褐色,核 有时可被阳性物质所掩盖而不显。 每个标本随机计数个细胞中的阳性细胞数,并对阳性细胞进行积分, 以阳性积分值作为.蛋白免疫组化检测的结果。计算方法如下: 蛋白阳性细胞比例%阳性染色细胞数/ %积分值积分 细胞数 积分细胞数积分细胞数/ .硝酸还原酶法测定含量 本方法主要是利用硝酸还原酶的特异性将;还原为;,通过显色深浅 测定其浓度,按照一氧化氮试剂盒说明书操作。 取干预后的各组细胞培养液按照下表操作: 空白管 标准管 测定管 . 双蒸水. /标准应用液 . 样本 . . . 混合试剂 混匀,?水浴, . . . 试剂三 . . . 试剂四 材料与方法 充分漩涡,混匀,室温静置,.转/分,离心 ,取上清 显色。 . . . 上清 . . . 显色剂 混匀,室温静置,蒸馏水调零,,测各管吸光度值。 计算公式: 含量 /测定管吸光度一空白管吸光度/标准管吸光度 一空白管吸光度×标准品浓度×样品测试前稀释倍数 .酶联免疫分析法测定含量 本实验采用双抗体夹心酶标免疫分析方法测定培养液中的含量,用纯 化的抗体包被微孔板,制成固相抗体,向包被单抗的微孔中依次加入抗原、 生物素化的抗人抗体、标记的亲和素,经过反复洗涤后用底物 显色。在氧化物酶的催化下变成蓝色,并且在酸的作用下变成黄色。通过 颜色深浅,用酶标仪在波长下测定样本的吸光度,计算样品浓度。具体 操作按照测定试剂盒说明书进行。 加样:分别设定标准孔、空白孔、待测样品孔。除空白孔外,其余的各 孔分别加入标准溶液或者待测样品,不要有空泡,混匀,在酶标板上加上 盖,?,。 弃去液体,甩干,不用洗涤。并且在各孔中加检测溶液工作液, ?,,洗次板,/孔,甩干。 ?,,洗次板,甩干。 在各孔中加检测溶液工作液., 依次在各孔中加底物溶液,?,避光显色可见标准品的 前.孔有明显的梯度蓝色,后.孔梯度不明显。 依次在各孔中加终止溶液,终止反应有蓝色立刻转为黄色,用 酶标仪在波长依次测定各孔的吸光度值。 计算:以标准物浓度为横坐标,值为纵坐标,在半对数坐标纸上绘标材料与方 法 准益线,根据样本的值在标准曲线上查出相应的浓度稀释倍数,即可得出 样本的实际浓度。 ..检测细胞.蛋白的表达 .细胞磷酸化蛋白的提取 吸去培养基后,加入冷洗两次,每次振摇数次以尽量去除培养液; 常规消化细胞,加入.%胰酶,将消化的细胞用移液管移至离心 管,离心/,弃去上清液,加入冷将细胞移至. 管,离心/,弃掉,用移液器小心吸取残留的液体: 加入 磷酸酶抑制剂, 蛋白酶抑制剂和 在每冷,混匀,冰上保存数分钟待用; 在上述离心管的细胞中,每 个细胞中加入上述配好的冷 : 置于摇床平台上,温和振荡 置于预冷的离心机中 /,。离心,取上清为磷酸化蛋白 提取物,分装在标记好的管,.?冰箱保存。 .蛋白浓度测定 按:的比例配制与试剂,配制适量工作液,充分混匀。 工作液室温小时内稳定; 完全溶解蛋白标准品,用%将其稀释至,从而使终浓度 为./: 将标准品以此加入,,,,,,,加到孔板的标准品 孔中,并加%补足到: 将各组蛋白加入到各孔,并标记; 分别在各孔中加入工作液,放置分钟; 波长测定吸光度,依次测定个样品浓度,取三个反应均值,单位 材料与方法 /。 .聚丙烯酰胺凝胶.电泳 将两块玻璃板充分洗净,烘干,置放在夹中卡紧,准备灌胶; 配制%的分离胶,混匀,灌胶,再用纯水覆盖; 分钟后,分离胶凝固,弃去上面的液体,用滤纸吸干,注意不能接触 胶平面; 制备%的浓缩胶,混匀,注意不要过于剧烈,灌入浓缩胶,小心插入梳 子,注意不能产生气泡; 小时后,浓缩胶凝固,将梳子轻轻垂直拔出,并且充分清洗各孔,洗去 未聚合的聚丙稀酰胺; 放入电泳槽中,并加入电泳液; . 样品准备:将蛋白样品与样品缓冲液 置于管中混 合,?加热分钟; 上样:根据蛋白浓度测定选取的加样量,使用专用上样器加样到各孔, 勿溢出加样孔。并加入有预染作为指示; :电压,以染料的前沿迁移至凝胶的底部为标准终止电泳,进 电泳 行转膜; .转膜 配制转膜缓冲液,准备滤纸与膜,并在膜上作标记: 将膜浸泡于转膜缓冲液, 将海绵及滤纸浸泡在转膜液中,依次由上向下:海绵、三层滤纸、胶、 膜、三层滤纸、海绵;盖好后将盒子放在转膜仪上,胶朝负极,膜朝『极; 转膜:采用恒流,转膜小时。 .膜的封闭和抗体孵育 转完膜后,将膜取出在%溶液中室温孵育,.洗膜 ×次; 材料与方法 用.稀释一抗兔抗人磷酸化抗体,将封闭过的膜加入 一抗:、抗体作内参对照,室温孵育或过夜,. 洗膜 次; 加辣根酶标记山羊抗兔:孵育.,用洗 次。 .化学发光法显色 严格按照化学发光试剂盒操作,将和两种试剂等体积混合,室 温放置 将检测试剂均匀滴与膜上,充分接触,用滤纸去除膜上液体, 用保鲜膜包好膜:载底片,压片,显影,定影,胶片晾干后扫 描,并将条带进行狄度测定分析。 .?检测细胞蛋白的表达 具体步骤详见实验步骤,其中一抗使用兔抗人抗体:。 三统计学处理 采用.软件进行统计学分析。定量资料用?表示,多组资料间的 比较采用方差分析,两两比较采用的方法。检验水准.。 实验结果 实验结果 二甲双胍对细胞.及表达的影响 .在细胞的阳性表达主要表现为胞膜着色为棕褐色。与空白 对照组相比,组的棕褐色表达数目较多,颜色较深,?的表达明显上 调图,:按阳性细胞数所占比例以及染色深浅对阳性细胞进行积分,进行 免疫组化评分,结果分别是.?.、.?.,二者比较有显著差异 .。 在细胞的阳性表达主要表现为胞膜着色为棕褐色。与空白对 照组相比,组的棕褐色表达数目较多,颜色较深,的表达明显上调图 .。按阳性细胞数所占比例以及染色深浅对阳性细胞进行积分,进行免疫组 化评分,结果分别是.?.、.?.,均具有统计学意义.。 目? ~. 一。中. 、 鼍, ,“扩:‰ ??? ???乙 一??论奠,分:盎 网同圜 图免疫细胞化学检测二甲双胍对细胞及表达的影响 沌 为组农达.为窄白组表达,为组表达,为窄白对照组表达, ;为组表达. 为组农达,以.卜为染色.。 .始为染色, 以 实验结果 二甲双胍对软脂酸诱导的人脐静脉内皮细胞培养液中一氧化氮的影响 与空白对照组相比,软脂酸组的培养液中一氧化氮生成减少;与软脂酸组 相比,组、组的培养液中一氧化氮生成增加:与空白对照组 相比,组、组的培养液中一氧化氮生成增加,且均具有统计学意义 .。 表二甲双胍对培养液中一氧化氮含量的影响 / 分组 .?. 对照组 .?. 软脂酸组 .?.? 二甲双胍组 组 .?.? 组 .?. 组 .?. 图二甲双胍对培养液中一氧化氮含量的影响 注所有数据以表示,?与对照组比较.‘.;.软脂酸组比较。.. 实验结果 二甲双胍对软脂酸诱导的人脐静脉内皮细胞培养液中内皮型一氧化氮 合酶的影响 与空白对照组相比,软脂酸组的培养液中内皮型一氧化氮合酶生成减少; 组、组的培养液中内皮型一氧化氮合酶生 与软脂酸组相比, 成增加;与空白对照组相比,组、组的培养液中内皮型一氧化氮合 酶生成增加,且均具有统计学意义.。 表二甲双胍对培养液中内皮型一氧化氮合酶含量的影响 / 分组 对照组 .?. .?. 软脂酸组 二甲双胍组 .?.? 组 .?. .?. 组 组 .?. 表 二甲双胍对培养液中内皮型一氧化氮合酶含量的影响 洼:所自.数据以表示??与对照组比较,.;撑与软脂酸组比较,.? 实验结果 二甲双胍对人脐静脉内皮细胞磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶表达的影响 与空白对照组相比,软脂酸组的.表达量低下;与软脂酸组相比, 组、组的.表达量增加;与空白对照组相比, 组、组的表达量增加,且均具有统计学意义.。 图二甲双胍对人脐静脉内皮细胞?蛋白表达水平的影响 注:为组,为空白对照组,为组,为组,为组。为组 图二甲双胍对人脐静脉内皮细胞蛋白表达水平的影响 。 实验结果 二甲双胍对人脐静脉内皮细胞内皮型一氧化氮合酶表达的影响 软脂酸组的内皮型一氧化氮合酶表达量低下:与软脂 与空白对照组相比, 酸组相比,组、组的内皮型一氧化氮合酶表达量增加;与空 白对照组相比,组、组的内皮型一氧化氮合酶表达量增加,且具有 统计学意义.。图二甲舣胍对人脐静脉内皮细胞蛋白表达水平的影响 注:为组,为窄白对照组。为组,为组,为组,为组 图二甲双胍对人脐静脉内皮细胞蛋白表达水平的影响 讨论 讨 论 内皮细胞是一个重要的旁分泌和内分泌器官,它可以调节血管的细胞组成 和舒缩状态,血管内皮功能障碍是动脉粥样硬化的早期表现之一【。内皮功 能 障碍的重要特征是内皮源性的合成、释放和活性受损。动脉粥样硬化是冠心 病等多种严重威胁人类健康疾病的共同病理基础,已经成为我国主要的死亡 原 因。内皮功能对心血管功能的正常发挥具有重要的调节作用,内皮细胞的异 常 往往是导致心血管疾病发生的关键因烈,并且是血管并发症形成的始动 环节。 作为一种重要的蛋白激酶被称为“能量感受器【,同时可以介导 细胞对营养和环境的变化适应,被称为“能量感受器”。可以通过抑制糖 原、脂肪和胆固醇的合成,促进脂肪酸氧化、葡萄糖转运调节糖脂代谢;可以 通过磷酸化激活内皮型一氧化氮合酶,促进一氧化氮生成,从而调节血管张 力; 从而减轻炎症反应【。 的激活减少介导的上皮氯化物的分泌, 是一种三聚体 蛋白激酶复合物。催化亚基含有激酶的活性功 能域及调节功能域,亚基为连接和亚基的桥梁,亚基的末端有个 功能域,主要用于结合及三磷酸腺苷,以调节的活性。 受的变构激活,高浓度的能够拮抗的这种激活作用, :比值升高激活的作用远远大于单独对的激活【】。 当体内能量缺乏时,通过/比值调节的活性。当缺氧、低氧、 与氧化磷酸化受抑制时,/比值与肌酸:磷酸肌酸比值升高,被 磷酸化,从而可以被激活。另外,还通过上游的激酶 .催化亚单位的苏氨酸残基磷酸化而被激活,亚单位的第 位苏氨酸残基是已知的具有特征性的磷酸化激活位点【。本研究在人脐静脉 内 皮细胞内,则以 苏氨酸磷酸化作为活化的标志。最近有研