氟化物对FRTL细胞甲状腺激素代谢相关基因表达的影响

氟化物对FRTL细胞甲状腺激素代谢相关基因 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达的影响 氟化物对FRTL细胞甲状腺激素代谢相关 基因表达的影响 中国兽医2009年7月第29卷第7期砌JVetsJul.2009Vo1.29No.7885 氟化物对FRTL细胞甲状腺激素代谢相关基因表达的影响 江鹏,张维东.,柴春彦,肖睿,丁明星.,刘国艳"(1.上海交通大学农业与生物学院,上海200240; 2.华中农业大学动物医学院,湖北武汉430070;3.甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州730070) 摘要:为探讨氟对FRTL细胞甲状腺球蛋白(TG),甲状腺过氧化物酶(TP0)和钠碘转运体(NIS)基因表达的影响, 传代培养FRTL细胞,在对数生长期用氟化钠处理,使培养液中的氟浓度分别为20,10,5,2.5,1.25mg/I,同时设 空白对照细胞.培养72h后收集细胞;采用半定量RT—PCR 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 FRTL细胞TG,TPO,NISmRNA和f3-actin表 达水平.试验结果表明,与对照细胞相比,较低浓度氟化钠处理的FRTL细胞TG基因表达量代偿性升高,随氟质 量浓度增加(5.0mg/L以上),TG表达量显着降低(P<0.05);各个浓度氟化钠处理的FRTL细胞TPO,NIS基因 表达量均下降或显着下降(P<O.05).由此可知,氟化物降低了甲状腺细胞TG,TPO,NIS基因表达水平,造成甲 状腺摄取和利用碘,甲状腺激素合成,贮存,分泌功能障碍,进而导致甲状腺结构和功能异常. 关键词:氟化物;FRTL细胞;甲状腺球蛋白;甲状腺过氧化物酶;钠碘转运体 中图分类号:$859.7文献标识码:A文章编号:1005—4545(2009)07—0885—04 Effectsoffluorideontheexpressionoffunctionalgenesrelatedwiththemetabo- lismofthyroidhormoneinFRTLcells JIANGPeng,ZHANGWei—dong.,CHAIChun—yan,XIAORui,DINGMing— xing.,LIUGuo—yan (1.CollegeofAgricultureandBiology,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200240,Chi— na;2.CollegeofAnimalMedicine,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China;3. CollegeofAnitaulMedicine,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China) Abstract:Toinvestigatetheeffectsoffluorideontheexpressionofthyroglobulin(TG),thyroidperoxidase (TPO),odiumiodidesymporter(NIS)genesinFRTLcells,FRTLcellsculturedinvitroweretreatedinlogarithmic phasewithsodiumfluorideatdifferentconcentrationof2O.0,l0.0,5.0,2.5,1.25mg/L,respectively.After72h, thecellswerecollectedandsemi— quantitativeRT-PCRforTGmRNA,TPOmRNAandNISITIRNAand8一aetin,=|,as performed.Theresultsshowedthatcomparedwiththecontrolcells,theexpressionlevelsofTGgeneinFRTLceils treatedwithlowerconcentrationofsodiumfluorideincreasedcompensatively,butdecreasedsignificantly(P<O.05) withhigherconcentration(>5.0mg/L):theRT, PCRproductsofTPoandNISinFRTLcellstreatedwithallcon— centrationofsodiumfluoridereduced,someofthemweresignificant(P<O.O5).ItiSconcludedthatfluoridecanre— ducetheexpressionofTG,TPO,NISgenesinthyroidcells,conseguentlycausedysfunctionofthyroidinuptaking andunilizingofiodine,andsynthesizing,storing,secretingofthyroidhormones. Keywords:fluoride;FRTLcells;thyroglobulin(TG);thyroidperoxidase(TPO);sodiumiodidesymporter(NIS) *Correspondingauthor 氟化物能导致动物甲状腺结构损伤,引起甲状 腺组织肿大以及合成和分泌甲状腺激素(TH)功能 障碍.目前,氟化物导致甲状腺损伤的复杂作用 机理还没有阐明.已知甲状腺球蛋白(TG),甲状腺 过氧化物酶(TPo),钠碘转运体(NIS)在甲状腺激 收稿日期:2008—04—06 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30671544) 作者简介:江鹏(1983一),男,硕士. *通讯作者 素的合成,分泌以及维持甲状腺正常结构过程中发 挥着重要作用[451.其中,TG是碘化酪氨酸和甲状 腺激素合成的载体,也是碘和甲状腺激素的贮存形 式L6;TPO是维持甲状腺功能正常的关键酶,促进 碘的活化,酪氨酸的碘化和偶联形成具有生物活性 的甲状腺激素;NIS介导和促进甲状腺细胞摄取 碘?8j.这些因子是合成和分泌甲状腺激素以及决定 甲状腺功能的关键蛋白,其编码基因表达正常与否, 直接影响到甲状腺结构和功能.本试验用氟化物处 理体外培养的大鼠甲状腺细胞系(Fisherratthy— 886中国兽医2009年7月第29卷第7期ChinJVetSciJu1.2009Vo1.29No.7 roidcellline,FRTL)细胞,观察氟化物对编码 FRFL细胞TG,TPO,NIS蛋白基因表达的影响, 从而在一定程度上为揭示氟引起甲状腺结构和功能 损伤的分子机理提供理论依据. 1材料与方法 1.1主要仪器和试剂3U1型CO细胞培养箱, 美国产;细胞超声破碎机,宁波新芝生物科技公司; 分光光度计,Eppendorf;MIAS一2000型凝胶成像分 , 析系统,'Vilber-Lourmat公司;PTC一200PCR仪Bio—Rad公司;RPMI一1640培养基和青链霉素,GIB— CO公司;胎牛血清,Hyclone公司;L一谷氨酰胺,吉 诺生物医药技术有限公司;牛TSH,猪胰岛素,转铁 蛋白和氢化考的松,Sigma公司;氟化钠(分析纯,上 海凌峰);RT—PCR试剂盒,TaKaRa,Oligo(dT)18, TaKaRa;PCR引物,上海生工生物工程技术服务公 司提供;DNAMarker,上海捷瑞生物有限公司提 供. 1.2FRTL细胞培养采用ATCC提供的FRTI 细胞(CRTL一1468)传代培养,完全培养基配方由 ATCC提供,RPMI一1640培养基,10的胎牛血清 (Hyclone),青链霉素在培养基中均为100U/mI, 牛TSH为0.01U/L,猪胰岛素为10mg/L.转铁蛋 白10mg/i,氢化考的松3.5mg/L,每100mL完 全培养基加1mLL一谷氨酰胺,在培养FRTL细胞 前1d制备完全培养基,完全培养基过滤分装,4? 备用;细胞置37?,59/6CO细胞培养箱培养,及时 观察细胞生长情况. 1.3氟化钠处理FRTL细胞和细胞的收集保存 细胞长满后(细胞存活率95以上),本试验在细胞 对数生长时加入不同水平的氟,细胞贴壁情况良好, 细胞存活率95以上,保证氟攻毒试验的正确性和 合理性.将细胞接种到6孔培养板中培养,接种数 目约1.0×10个/mL,定时观察细胞生长情况,当 细胞长至50,60时用氟化钠(Sodiumfluoride, NaF)处理,使NaF在培养基中质量浓度分别为20, 1O,5,2.5,1.25mg/L,同时设空白对照细胞.72h 后收集FRTL细胞置无RNA酶EP管,一8O?冰 箱保存. 1.4FRTL细胞RNA提取和 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 每管细胞(细 胞密度5.0×10个/mL)加1mL的Trizol试剂,反 复冻融,超声破碎5次,补加500LTrizol充分作 用细胞,提取细胞中的总RNA,8O的乙醇洗涤2 次,干燥后DEPC水稀释,分光光度计检测230, 260,280rim的D值,计算RNA的浓度,D26./D28. 和D../D?比值,RNA变性电泳检测RNA质量. 1.5合成cDNA和PCR反应以2g的总RNA 为模板,Oligo(dT)18作引物,使用AMV逆转录 体系25L,42?水浴60min合成cDNA; 酶,反应 PCR引物设计参照文献[9—11],以cDNA为模板, cDNA3.0tLL,10×buffer2.5uL,2.5U//xLTaq 酶1.0L,dNTP0.5L,MgC122.0tzL,TG,NIS, TPO基因和t?-actin上,下游引物均为1.0L,总反 应体系为25L.PCR反应条件为94C预变性5 min,94C45S,退火30S,72.C延伸30S,35个循环, 其中actin为40个循环,72?最后延伸10min. 表1TG,TPO,NIS,0actin的引物序列 引物 TG TP0 NIS 引物序列塑垦堡壁!望壁兰!竺!::1 58057.02.0上游:5'-CAGCTATGGCAACAGAACT'I..3 下游:5'-GTGGCTCCAT1,CCCTCACT3 ,游:5GTCTGTCACGCTGGTTATGG-3 下游:5一CAATCACTCCGCTTGTTGGC,3 上游:5'-GGTGATCCTGGCCCGAGGCGTCA3 下游:5'-CCACTGTAAGCACAGGCCAGGAA一3 ~t-actin上游:5一TGACGGG("TCACCCACACFGGc《I:Arcj'A3 下游:5'-CTAGAAGCAT'I,TGCGGTGGPCGI((;AGGG一3 1.6PCR产物电泳及光密度测定取1c"IPCR 产物进行1.0琼脂糖凝胶电泳.电泳结譬用紫:卧 透射仪观察并摄取图像,应用MIAS一2000固缘分析 系统进行光密度值测定.以每一样品的,IG,TP(), NIS基因光密度与其内参G—actin的光密}}蟑袭 示该样品PCR产物的相对含量. 17数据分析与处理应用SAS软件对所得数据 ,数据以?5表 进行草图索方差分析进行t检验 示. . 9结果 2.1FRTL细胞RNA提取结果提取的细胞 中国兽医2009年7月第29卷第7期ChinJVetSciJu1.2009Vo1.29No.7887 RNA用DEPC水稀释,检测到D../D..为1.7, 1.9,D.../D2.值为2.0以上.RNA变性电泳可见 明显的28S和18S条带,可见部分5S条带.检测 到RNA水平为0.5,0.85g/L,因而提取的总 RNA质量良好,可用于反转录合成cDNA. 2.2氟化钠处理的FRTL细胞功能基因表达结果 2.2.1氟化钠处理的FRTL细胞TG基因表达 由图1可知,随着氟化钠质量浓度的增加,FRTL细 胞TG基因表达量逐渐增加,当氟化钠质量浓度为 5.0mg/L时,FRTL细胞TG基因表达量最高;而 随着氟化钠的质量浓度进一步升高,TG基因表达 量则呈现逐渐降低的趋势. bp 200 000 800 600 400 200 B-aetin TG 图1不同水平氟化钠处理的FRTL细胞TG基因RT_PcR 产物电泳结果M.DNAMarker;1,6.分别为0, 1.25,2.5,5.0,10.0,20.0mg/L氟化钠处理72h的 FRTL细胞TG基因表达情况 2.2.2氟化钠处理的FRTL细胞TPo基因表达 由图2可知,随着氟化钠质量浓度的增加,FRTL 细胞TP0基因表达量逐渐降低. 2.2.3氟化钠处理的FRTL细胞NIS基因表达情 588 800 6OO 400 200 图2不同水平氟化钠处理的FRTL细胞TPO基因RT- PCR产物电泳结果M.DNAMarker~1,6.分别为 0,1.25,2.5,5.0,10.0,20.0mg/L氟化钠处理72h 的FRTL细胞TG基因表达情况 bp 200 000 800 600 400 200 -~ttn NlS 图3不同水平氟化钠处理的FRTL细胞NIS基因RT- PCR产物电泳结果M.DNAMarker~l,6.分别为 0,1.25,2.5,5.0,10.0,20.0mg/L氟化钠处理72h 的FRTL细胞TG基因表达情况 况由图3可知,氟化钠质量浓度为0,1.25,2.5, 5.0mg/L时,FRTL细胞NIS基因表达量相似,氟 化钠质量浓度为10.0,2O.0mg/L时,与对照(0 rag/L)细胞相比NIS基因表达量明显减少. 2.3氟化钠处理的FRTL细胞TG,TPO,NISRT- PCR产物电泳条带相对光密度值检测结果由表2 可知,氟化钠处理的FRTL细胞TG,TPO,NIS相 表2氟化钠处理的FRTL细胞TG,TPO,NISRT—PCR产物相对光密度值(士s) 注:*表示该浓度氟化物处理的细胞与对照细胞相比差异显着(P<0.05) 对光密度值的变化趋势与上述电泳图谱显示的结果 一 致.随着氟化钠质量浓度的增加,FRTL细胞 TG基因表达量表现为先显着增加而后显着降低的 趋势(P<O.05);而TPO基因表达量大体上随着氟 化钠质量浓度升高而不同程度降低(2.5mg/L及以 上质量浓度显着降低,P<0.05),呈现明显的剂 量,反应关系;较低质量浓度氟化钠处理的细胞 NIS基因表达量与对照细胞相似,高质量浓度时 (10.0,2O.0mg/L)时,NIS基因表达量则明显降低 (P<O.05). 3讨论 本试验选择进行体外培养FRTL细胞,研究氟 化物损伤甲状腺的机理.体外试验排除了下丘脑 腺垂体一甲状腺系统的调节作用,影响因素单一,更 能直接地揭示氟化物对甲状腺功能因子影响作用. 由试验结果可知,氟化钠处理的FRTL细胞 TG基因表达量在较低质量浓度的氟化钠作用下, 888中国兽医2009年7月第29卷第7期ChinJVetSciJul.2009Vo1.29No.7 呈现代偿性升高,随着氟化钠质量浓度的增加,这种 代偿作用丧失,TG基因表达量显着降低.这样就 有可能造成甲状腺功能蛋白TG量低于正常,使得 碘化酪氨酸和甲状腺激素合成的载体不足,碘以及 合成的甲状腺激素无法在甲状腺滤泡中正常贮存; 氟化物能够导致TPO活性下降已得到相关研究的 验证[1引.在本试验中,各个氟处理质量浓度的 FRTL细胞均表现为TPO,NIS基因表达量下降. TPO基因表达量下降造成的甲状腺功能关键酶 TPO合成不足以及活性下降,必然导致碘的有机 化,酪氨酸的碘化和偶联障碍;NIS是一种位于甲状 腺滤泡细胞膜上的糖蛋白,主要在甲状腺滤泡的基 底外侧膜进行表达.NIS作为"碘泵"是促进血液中 的碘逆浓度梯度向甲状腺中转运的关键因子,NIS 基因表达量下降必然导致碘的转运障碍和甲状腺细 胞摄碘率降低,从而不能合成足够的甲状腺激素. 总之,上述3种甲状腺功能蛋白在氟化物作用下基 因表达水平均呈下降趋势,直接造成甲状腺摄取和 利用碘,甲状腺激素合成,贮存,分泌功能损伤,并进 而导致甲状腺结构和功能异常.氟化物损伤甲状腺 的分子机理十分复杂,还需要进一步的体内,体外试 验来加以综合阐述. 参考文献: [1]LeiteAdeL,SantiagoJFJr,LevyFm,eta1.Absence ofDNAdamageinmuhipleorgansafteracutefluoride exposureinrats[J].HumExpToxicol,2007,26(5): 435-440. [2]刘国艳.鸡氟中毒机理的研究[D].哈尔滨:东北农业 大学,2000:l14一ll7. [3]李红,高明涛,许珂玉,等.原代培养猪甲状腺细胞及 甲状腺过氧化物酶活性与氟化钠的影响[J].中国组 织工程研究与临床康复,2007,37(11):7425-7428. [4]孙云,聂秀玲,李兰英,等.TSH和高碘对FRTL细 胞甲状腺激素合成相关基因表达的影响[J].中国地 方病学杂志,2005,3(24):255-257. [53SpitzwegC,HeufelderAE,MorrisJC.Thyroidiodin— etransport[J].Thyroid,2000,10(4):321—330. E6]杨秀平.动物生理学[M].北京:高等教育出版社, 2002:336—337. [7]KavokNS.Thestructureandregulationofenzymesof thyroidhormonopoesis[J].UkrBiokhimZh,2006,78 (1):5-19. 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