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甲基化检测甲基化研究方法学回顾 1 整体水平甲基化分析 1.1 高效液相色谱 柱(HPLC)及相关方法 HPLC是一种比较传统的方法,能够定量测定整体水平DNA 甲基化水平。它由Kuo等1980年[18]首次报道。过程是将DNA 样品先经盐酸或氢氟酸水解成碱基,水解产物通过色谱 柱,结果与标准品比较,用紫外光测定吸收峰值及其量,计算5m C/(5m C+5℃)的积分面积就得到基因组整体的甲基化水平。这是一种检测DNA 甲基化的标准方法。但它需要较精密的仪器。Fraga等2002年[19]运用高效毛细管电泳法(HPCE)处...

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甲基化研究方法学回顾 1 整体水平甲基化 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 1.1 高效液相色谱 柱(HPLC)及相关方法 HPLC是一种比较传统的方法,能够定量测定整体水平DNA 甲基化水平。它由Kuo等1980年[18]首次报道。过程是将DNA 样品先经盐酸或氢氟酸水解成碱基,水解产物通过色谱 柱,结果与 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品比较,用紫外光测定吸收峰值及其量,计算5m C/(5m C+5℃)的积分面积就得到基因组整体的甲基化水平。这是一种检测DNA 甲基化的标准方法。但它需要较精密的仪器。Fraga等2002年[19]运用高效毛细管电泳法(HPCE)处理DNA 水解产物,以确定5mC的水平。与HPLC相比,HPCE更加简便、快速、经济。HPLC及HPCE测定整体DNA 甲基化水平的敏感性均较高。Oefner等1992年[20]提出变性高效液相色谱 法(DHPLC)用于分析单核苷酸和DNA 分子。邓大君等2001[21]将其改进与PCR联用建立了一种检测甲基化程度的DHPLC分析方法。将重亚硫酸盐处理后的产物进行差异性扩增,由于原甲基化的在重亚硫酸盐处理时仍被保留为胞嘧啶,因此原甲基化的在PCR扩增时,其变性温度也相应上升,使PCR产物在色谱 柱中保留的时间明显延长,这样就可以测定出PCR产物中甲基化的情况。 这种方法的最明显优点是:可用于高通量混合样本检测,能够明确显示目的片段中所有CpG位点甲基化的情况,但不能对甲基化的CpG位点进行定位。 1.2 SssI 甲基转移酶法[22] SssI甲基转移酶能够催化DNA 的CpG位点发生甲基化。3 H-S-腺苷甲硫氨酸(3 H-SAM)在SssI甲基转移酶催化作用使基因组DNA 的CpG位点发生甲基化。通过测定剩余的放射性标记的SAM即可得到原整体甲基化水平,即测到的放射性强度与所测DNA 甲基化水平成反比。这种方法的缺点是所使用的SssI甲基转移酶不稳定,致结果不够精确。 1.3 免疫化学法[23] 这种方法是基于单抗体能够与5m C发生特异性反应。应用荧光素标记抗体使之与预先已固定在DEAE膜上的样品DNA 特异性结合,对DEAE膜上的荧光素进行扫描得到5m C的水平,其荧光素强度与5m C水平成正比。Oakeley等1997年[23]报道了这种方法。这种方法需要精密的仪器。 1.4 氯乙醛法 Oakeley等1999年[24]首先描述了这种使用氯乙醛和荧光标记的方法。首先,将DNA 经重亚硫酸盐处理使未甲基化的胞嘧啶全部转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变(Frommer等1992年)[25],然后经过银或色谱 柱去除DNA 链上的嘌呤,再将样品与氯乙醛共同孵育,这样5m C就转变为带有强荧光的乙烯胞嘧啶,荧光的强度与原5m C的水平成正比。这种方法可以直接测定整体5m C水平。其优点是所用试剂价格低廉且稳定性好,避免了放射性污染,但缺点是费时费力,而且氯乙醛是一种有毒的物质。 2 特异性位点的DNA 甲基化的检测 2.2.1 甲基化敏感性限制性内切酶(methylation-sensitive restriction Endonuclease,MS-RE)-PCR/Southern法 这种方法利用甲基化敏感性限制性内切酶对甲基化区的不切割的特性,将DNA 消化为不同大小的片段后再进行分析。常使用的甲基化敏感的限制性内切酶有HpaⅡ-MspⅠ(识别序列CCGG)和SmaⅠ-Xmal(CCCGGG)等。由于后者识别的碱基数相对较多,其碱基序列在体内出现的概率相对较低,所以以前者即HpaⅡ-MspⅠ更常用。其中HpaⅡ和MspⅠ均能识别CCGG序列,然而当序列中的胞嘧啶发生甲基化时,HpaⅡ不切割,利用HpaⅡ-MspⅠ的这种属性处理DNA ,随后进行Southern或PCR扩增分离产物,明确甲基化状态[12][26]。 这是一种经典的甲基化研究方法,其优点是:相对简单,成本低廉,甲基化位点明确,实验结果易解释;缺点是:1.由于CG不仅仅限于CCGG序列中,因此非该序列中的CG将被忽略;2.只有检测与转录相关的关键性位点的甲基化状态时,该检测方法的结果才有意义;3.相对而言,Southern方法较复杂,且需要样本的量大;4.存在着酶不完全消化引起的假阳性的问题;5.不适用于混合样本。 2.2 直接测序 法 直接测序 是由Frommer等[25]提出的研究DNA 甲基化方法。过程是:重亚硫酸盐使DNA 中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变(见图1),行PCR扩增所需片段,则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶,最后,对PCR产物进行测序 并且与未经处理的序列比较,判断是否CpG位点发生甲基化。此方法是一种可靠性及精确度很高的方法,能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态,但需要大量的测序 ,过程较为繁琐、昂贵[27]。 图1:重亚硫酸盐处理过程示意图。DNA 经重亚硫酸盐处理后,甲基化的胞嘧啶不变,未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶 2.3 甲基化特异性的PCR(methylation-specific PCR,MS-PCR) Herman等1996年[28]在使用重亚硫酸盐处理的基础上新建的一种方法。它将DNA 先用重亚硫酸盐处理,这样未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶,而甲基化的不变,随后行引物特异性的PCR。MS-PCR中 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 两对引物,并要求:1.引物末端均设计至检测位点结束;2.两对引物分别只能与重亚硫酸盐处理后的序列互补配对,即一对结合处理后的甲基化DNA 链,另一对结合处理后的非甲基化DNA 链。检测MSP扩增产物,如果用针对处理后甲基化DNA 链的引物能扩增出片段,则说明该被检测的位点存在甲基化;若用针对处理后的非甲基化DNA 链的引物扩增出片段,则说明被检测的位点不存在甲基化(见图2)[26][27]。 图2:甲基特异性的PCR扩增(MS-PCR)示意图。DNA 经重亚硫酸盐处理后,以处理后的产物作为模板,加入甲基化特异性的引物(primerⅠ)或非甲基化的引物(primerⅡ),进行特异性的扩增(如图所示),只有结合完全的甲基化或非甲基化特异性引物的片段才能扩增出产物。 这种方法的优点是:1.避免了使用限制性内切酶及其后续相关问题;2.敏感性高;可用于石蜡包埋样本[12];缺点是:1.要预先知道待测片段DNA 的序列;2.引物设计至关重要;3.若待测DNA 中5-甲基胞嘧啶分布极不均衡,则检测时较为复杂;4.这种方法只能作定性研究,即只能明确是否存在甲基化;若要求定量,则需用其他的方法进行进一步检测;5.存在重亚硫酸盐处理不完全导致的假阳性。 2.4 甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(methylation-sensitive single nucleotide primer extension,Ms-SnuPE) Gonzalgo and Jones 1997年提出了结合重亚硫酸盐处理和单核苷酸引物延伸(Kuppuswamy等1991年提出[29])的Ms-SnuPE方法[30],用于定量检测已知序列中特异位点的甲基化水平。过程是:先将研究序列用重亚硫酸盐处理,未甲基化的胞嘧啶全部转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变。进行PCR扩增,然后取等量扩增产物置于2管中,分别作为Ms-SnuPE单核苷酸引物延伸的模板。设计用于Ms-SnuPE延伸的引物的3’端紧邻待测碱基。同时于2个反应体系中加入等量的Taq酶、引物、同位素标记的dCTP或dTTP。这样,如果待测位点被甲基化,则同位素标记的dCTP会在反应延伸时连于引物末端;若是未被甲基化,则标记的dTTP参与反应。末端延伸产物经电泳分离和放射活性测定后可得出C/T值,即为甲基化与非甲基化的比值,从而分析得到待测片段中CpG位点甲基化情况[5][29](见图3)。同理也可以用dGTP或dATP。而且,若需研究一条链上不同位点CpG甲基化情况,可通过设计不同的引物在同一反应中完成[12]。 图3: 甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms-SnuPE)示意图。DNA 经重亚硫酸盐处理后,以PCR扩增后得到产物作为Ms-SnuPE延伸的模板,于反应体系中入设计好的引物和同位素标记的dCTP或dTTP进行甲基化特异的单核苷酸引物延伸,随后,电泳分离、测定同位素放射活性,确定甲基化水平。 这种方法的优点:1.可以了解特异位点甲基化情况且不受内切酶的限制;2.通过设计的不同引物在同一延伸反应情况可以了解不同位点CpG甲基化的状况;3.可以检测出样本序列中分布不均匀的甲基化位点;4.是一种能够用于定量检测甲基化水平的方法;5.仅需少量的DNA 样本,可以用于石蜡包埋样本的测定。缺点是:1.实验步骤略复杂,若要检测多个位点时则需设计多个引物[5];2.存在放射性污染及重亚硫酸盐处理不完全的问题。 2.5 结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(combined bisulfite restriction analysis,COBRA) Xiong and Peter报道了COBRA[31]甲基化检测法。这种方法对标本DNA 行重亚硫酸盐处理及PCR扩增,处理后原甲基化的胞嘧啶被保留,而非甲基化的胞嘧啶变为胸腺嘧啶。随后用限制性内切酶对转化后PCR产物切割的特性以识别原标本DNA 的甲基化状况。(见图4)。 图4: 结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(COBRA)示意图。重亚硫酸盐处理DNA 后行PCR扩增,用限制性内切酶(BstUI)识别转化后序列中的酶切位点,消化产物电泳分离,与完全非甲基化阴性对照组比较,得出序列中特异位点甲基化水平(图4参考引文[31]并略加修改)。 这种方法的优点有:1.方法相对简单,不需预先知道CpG位点及样本序列;2.可以进行甲基化水平的定量研究;3.需要样本量少,可用于石蜡包埋样本的分析[32]。缺点是:1.只能获得特殊酶切位点甲基化情况,因此检测阴性不能排除样品DNA 中存在甲基化的可能[5];2.由于酶和PCR的使用,只能分析一种特定序列[5]。 2.6 甲基化敏感性单链构象分析(methylation-specific single-strand conformation analysis,MS-SSCA) 甲基化敏感性单链构象分析(MS-SSCA)又称重亚硫酸盐甲基化-PCR-SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphism,SSCP)(BiPS),由Maekawa等1999年[32]报道。方法是:先用重亚硫酸盐处理待测片段,针对非CG二核苷酸区设计引物进行PCR扩增,扩增产物变性后作非变性的聚丙酰胺凝胶电泳,由于DNA 电泳时的移动性取决于其二级结构即DNA 的空间构象,而后者又由DNA 碱基的序列决定。因此,经处理后变性的单链DNA 将停留在聚丙酰胺膜的不同位置上,这样甲基化与非甲基化的就被分离开,随后行单链构象多态性分析加以明确(见图5):
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分类:医药卫生
上传时间:2019-07-09
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