诺氟沙星（Norfloxacin）对蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）生长及抗氧化酶活性的影响

诺氟沙星（Norfloxacin）对蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）生长及抗氧化酶活性的影响 诺氟沙星(Norfloxacin)对蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)生长及抗氧化酶 活性的影响 第2卷第3期 2007年9月 生态毒理 AsianJournalofEcotoxicology V01.2.No.3 Sep.2007 诺氟沙星(Norfloxacin)对蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)生长及抗氧化酶活性的影响 聂湘平,鹿金雁,李潇,杨宇峰 暨南大学水生生物研究所,广州510632 摘要:以蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)为实验材料,研究了喹诺酮类药物诺氟沙星(Norfloxacin,NFLX)对小球 藻生长及抗氧化酶活性的影响.结果表明,NFLX对小球藻的96hEC为30.78mg?L,,属于低毒.NFLX暴露对小球 藻谷胱甘肽硫转移酶(GST)和过氧化氢酶(CAT)具有显着影响,当NFLX浓度高于30mg?L时,小球藻GST活性受 到显着诱导,并随NFLX浓度增加而显着升高,而小球藻CAT活性随NFLX暴露浓度的升高表现出先诱导后抑制现 象.NFLX对谷胱甘肽(GSH)和7乙氧基异吩唑酮脱乙基酶(EROD)的影响较弱.在低浓度NFLX暴露下,GST和 CAT可作为NFLX暴露的生物标记物. 关键词:蛋白核小球藻;诺氟沙星;急性毒性;抗氧化酶活性 文章编号:1673—5897(2007)3—32706中图分类号:Q949.2,R978.1,X171.5文献标 识码:A ToxicEffectsofNorfloxacinontheGrowthandtheActivityofAntioxidase ofChlorellapyrenoidosa NIEXiang—ping,LUJin—yan,LIXiao,YANGYu—feng InstituteofHydrobiology,JinanUniversity,Guangzhou510632 Received23March2007accepted24April2007 Abstract:ChlorellapyrenoidosawaschosenasthetestmaterialtostudythetoxiceffectsofNorfloxacinonalgaebyacute toxicitytestandabatteryofbiochemicalparameterssuchasEROD,GSTandCATenzymesactivitiesofalgaeinthisresearch. Theresultsshowedthatthe96hEC50was30.78mg'L,inNFLXexposure,NFLXwaslow— toxictoChlorellapyrenoidosa.The activitiesofGlutathioneS-transferase(GST)andcatalase(CAT)hadsensitiveresponsestotheexposureofNFLX.CATWas inducedatinitialstagesandinhibitedgraduallywiththerisingofNFLXconcentration;whileGSTwasinducedsignificantly whenexposedtoover30mg?L, NFLXandincreasedcontinuouslywiththerisingofNFLXconcentration.Theactivitiesof Glutathione(GSH)and7-ethoxyresorufin—O— deethylase(EROD)hadslightvariancesamongdifferenttreatmentsgroups.CATand GSTmayactasthepotentialbiomarkersofNFLXexposureatlowconcentrationtoChlorellapyrenoidosa. Keywords:Chlorellapyrenoidosa;Norfloxacin;acutetoxicitytest;antioxidaseactivity 收稿日期:2007.03—23录用日期:2007.04.24 基金项目:国家自然科学基金项目(No.40471118);国家自然科学基金委与广东省 联合基金项目(No.U0633006) 作者简介:聂湘平(1966一),男,博士,副教授;通讯作者(Correspondingauthor),E— mail:txpnie@jnu.edu.cn;Tel:020—85225808 328生态毒理第2卷 1gI~(Introduc廿.n)2 .2 随着我国水产养殖业的迅速发展,养殖病害 日趋严重,渔用药物在降低发病率和死亡率等方 面发挥了巨大作用.但由于渔药市场管理混乱, 养殖过程中滥用或误用渔药现象普遍存在,由此 带来的水产品质量及生态安全问题越来越引起人 们的重视.长期频繁使用抗生素所产生的药物残 留,耐药性微生物的增长以及对非靶生物的损伤 等问题,严重制约着水产业的健康可持续发展(王 冉等,2006).目前,抗生素药物引起的药物残留 及微生物耐药性已有大量的文献报道(吉彩霓等, 2005;罗晓燕等,2005;李兆新等,2001),但关于抗 生素药物对非靶生物的影响还缺乏足够的重视. 喹诺酮类药物具有广谱,高效,毒副作用小以 及不易产生耐药性等特点,在水产养殖中被广泛 使用.其中,诺氟沙星(Norfloxacin,NFLX)是喹诺 酮类抗菌药物的代表品种.Vaccaro等(2003)研究 表明鱼类生物体在代谢喹诺酮类药物的过程中产 生一些具有亲电子活性的中间产物,可能诱导生 物体内抗氧化酶活性的变化.藻类是水生生态系 统的初级生产者,也是水生生态毒理学重要的研 究对象之一.藻类与其他水生生物的关系十分密 切,然而抗生素药物残留对藻类的影响以及藻类 在吸收代谢这类药物过程中是否会发生抗氧化酶 活性变化目前还未见报道. 本研究就NFLX对小球藻的毒性及其对小球 藻抗氧化酶活性的影响进行了探讨,评价了谷胱 甘肽硫转移酶(GST),过氧化氢酶(CAT),谷胱甘 肽(GSH)和7一乙氧基一异吩唑酮一脱乙基酶 (EROD)对这类药物的响应及其作为喹诺酮类药 物生态毒性评价标记物的适用性. 2材料与方法(Materialsandmethods) 2.1藻种 蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)取自暨 南大学水生所藻种室,采用水生4号培养基培养, pH7.6,温度(24?1)?,光强4000Lx,光暗比12h: 12h.实验容器为500mL三角瓶,培养体积200mL. 藻类接种初始密度5×105个?mL,,每天人工摇动 3次以上,每次10min.隔96h移种1次,反复3次 以上,使之达到同步生长阶段.每次移种前进行 显微镜观察,检查实验藻液是否被污染. 试剂 NFLX为分析纯,购自浙江华义医药有限公司. 2.3急性毒性实验方法 NFLX用4%NaOH助溶,再用5%HC1调pH 至7.0,8.0,NFLX母液浓度为1000mg?L,,设0, 7.5,15,30,60,120mg?L6个梯度,每个处理设 3组重复,于0,24,48,72,96h后定时取样,用血 球计数板计数细胞密度,同时采用比色法(李合 生,2000)测定叶绿素a含量. 采用生长面积法(国家环保局,2002)计算 96hEC卯,计算公式如下: A=(Nl—N0)/2Xt1+(Nl+N2—2N0)/2X(t2一t1)+…+ (N一1+N一2No)/2X(to—to—1)(1) 其中:A:生长曲线以下面积;tn:实验开始后 第n次计数时间;N.:初始细胞密度;N:tn时刻细 胞密度. 生长抑制率(I)通过以下公式计算: I=(一A)/A(2) I:受试组与对照组相比细胞生长抑制率;: 对照组生长曲线以下面积;A:受试组浓度生长曲 线以下面积. 以I为纵坐标,浓度对数为横坐标作图,I= 50%所对应的浓度即为EC卯值. 叶绿素a的计算公式如下: 叶绿素a=11.64X(oD?一oD)一2.16x (OD一OD)+0.1X(OD630一OD蚀)(3) OD63o,OD645,OD668,OD铷分别为藻液在630, 645,663和750nm下的吸光值. 2.4酶活性测定 暴露96h后,分别取一定量藻液于60(0)opm离 心20min,弃去上清液,藻泥冷冻在一80?冰箱待 测.测定时将离心所得藻泥再悬浮于1.5mL, 0.1mol?L,,pH7.8的磷酸缓冲液中,超声波破碎 10min,镜检至无完整细胞为止,10000wm离心 20min,上清液为粗酶液. 蛋白及CAT的测定均参考《植物生理实验》 (郝再彬等,2004).蛋白测定采用考马斯亮兰法; CAT测定采用紫外吸收法,其中以1rain内A减 少0.1的酶量为一个酶活单位(U);GSH采用 DTNB显色法测定;GST采用南京建成生物公司的 第3期聂湘平等:诺氟沙星(Norfloxacin)对蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)生 长及抗氧化酶活性的影响329 GST试剂盒进行测定,在37?反应lmin扣除非酶 促反应,使反应体系中GSH浓度降低11xmol?L 为一个酶活力单位(U);EROD测定参考Pohl等 (1980)的快速终止荧光光度法并略有改进. 2.5数据分析 处理组与对照组数据采用单尾.检验法进行 比较,p<0.05,p<0.01分别表示与对照组差异显 着,差异极显着. 3结果与分析(Resultsandanalysis) 3.1NFLX对小球藻的急性毒性 NFLX暴露下,显微镜观察到部分小球藻细胞 形态发生变化,部分藻体出现细胞肿胀现象;在最 高浓度组(120mg?L)个别藻体细胞壁受到破坏, 藻体开始分解,培养液颜色变白. NFLX对小球藻生长抑制率(I)随浓度的增 加而增加(表1),当NFLX浓度为7.5mg?L时对 小球藻生长影响不大,抑制程度很弱,24,96h的 生长抑制率分别为0.019,0.087;当NFLX浓度为 15及30mg?L时对小球藻的抑制程度也较弱;当 浓度达到60mg?L时,NFLX对小球藻生长抑制 显着,24,96h的生长抑制率分别为0.859,0.889, 接近于100%抑制.当浓度达到120mg?L时 NFLX对小球藻生长影响极显着,24h生长抑制率 达到1.173.随暴露时间的延长,小球藻表现出对 NFLX的逐渐适应性或耐受性,在NFLX暴露24h 之后生长抑制率增加幅度很小. 由公式(1)计算得NFLX对小球藻96hEC卯 为30.78mg?L,,按照水生生物毒性分级(国家环 保局,1993),属于低毒. 表1NFLX对蛋白核小球藻的生长抑制率随时间和 浓度的变化 Table1ComparisonofgrowthinhibitionrateofChlorella pyrerwidosaexposedtodifferentconcentrationofNFLX anddifferenttime NFLX对小球藻叶绿素a含量的影响见图1. 随NFLX浓度的增大,小球藻叶绿素a含量逐渐 下降.随时间的延长,高浓度处理组叶绿素含量 增长减慢.7.5mg?L处理组96h暴露后叶绿素a 含量为对照组的85.6%,60mg?L处理组只有 19.5%,120mg?L处理组小球藻叶绿素a已基本 分解,只有对照组的2.3%左右.叶绿素a变化趋 势与细胞密度的变化趋势基本吻合,但比细胞生 长变化表现出更好的剂量.效应关系. 培养时间/h Time 图1NFLX对小球藻叶绿素a含量的影响 Fig.1EffectsofNFLXonthechlorophyllacontentof Chlorellapyrerwidosa 3.2NFLX对小球藻抗氧化酶活性的影响 NFLX对小球藻GSH含量的影响如图2所 示,从图2可以看出,NFLX各处理组相对对照组 其GSH含量均受到诱导,高浓度组(30,60, 120mg?L)与对照组间存在显着性差异(P< 0.05).当NFLX浓度达到60mg?L时诱导最显 着,GSH含量为对照组的1.26倍.随着NFLX浓 度继续升高,诱导有下降趋势. GST活性在低浓度暴露组(7.5,15mg?L)诱 导不显着.随着NFLX浓度的升高,GST活性逐渐 升高,当NFLX浓度大于15mg?L时,处理组与对 照组间存在显着性差异(P<0.05).NFLX为 120mg?L时,GST酶活性为对照组的2.34倍,受 到极显着诱导(P<0.01)(图3). NFLX对小球藻CAT活性的影响如图4所示, 由图4可以看出,低浓度NFLX即对小球藻CAT 表现出显着的诱导作用.当NFLX浓度为30mg?L 时,CAT活性为对照组的1.92倍,达到最大,差异 极显着(P<0.01).但随NFLX浓度继续增加,小球 藻CAT活性出现下降趋势.当NFLX浓度达到 120mg?L时,CAT被显着抑制(P<0.05),CAT活 性只有对照组的84%.NFLX对小球藻EROD活 050505050 43322ll0 日号IIQ8oI青曹0u ^.?g一,唧姐懈蝾古 生态毒理第2卷 性的影响如图5所示,由图5可以看出,随NFLX 浓度的增加,小球藻EROD活性没有显着变化(p> 0.05). i300 羞0200 0 10o O7.5153O6Ol2O NFLX浓度,(mg?L) ConcentrationofNFLX 图3不同浓度NFLX对小球藻GST活性的影响 (},}}分别表示与对照组相比,P<0.05,P<0.01; GST单位以蛋白质计) Fig.3EffectsofNFLXonGSTactivityofChloreUa pyrenoidosa(,料:comparedwiththecontrolgroup, p<0.05,p<0.01;GSTunity:U.mg一,calculatedwithprotein) 1.O O.8 O.6 O.2 矗 '重 ? 昌 A , 起 4讨论(Discussion) 抗生素药物NFLX对蛋白核小球藻的毒性属 于低毒,低浓度处理组NFLX对小球藻的生长抑 制作用很小,但也未表现出许多文献报道的有机 物低浓度暴露时对藻类生长的刺激作用(沈国兴 等,1999;杨志强等,2004).当NFLX浓度大于 30mg?L时小球藻的生长受抑制程度才比较明 显,高浓度NFLX暴露超过了藻细胞耐受极限,细 胞结构开始破裂,解体,藻细胞生长处于零增长或 负增长,以至生长无法完全恢复.随着培养时间 的增加,NFLX对小球藻生长的抑制程度有所增 加,但增加幅度很小,说明小球藻对NFLX有逐渐 适应的趋势. GST是一种重要的解毒酶,能催化GSH与许 多亲电子物质结合,从而解除内源性或外源性毒 物的影响.实验表明,当NFLX浓度达到30mg?L 后小球藻体内GST诱导明显,随着NFLX浓度的 升高,藻体内可能积累一些活性氧自由基或一些 亲电子次级产物,这可能导致GST被诱导,促使 GSH与其结合从而解除或降低毒性.有文献报道 生物体内细胞色素P酶在参与喹诺酮类药物代 谢过程中会产生具有亲电子活性的中间产物,从 而诱导某些抗氧化酶活性的响应(Vaccaroeta1., 2003;Arriagaeta1.,2000).GST活性的升高是藻 类抵御外源污染物的一种应激性反应(陈加平等, 1999),这在各种水生生物对污染物的暴露中均有 报道(周启星等,2004).作为生物体内重要的非 酶系抗氧化系统的成分之一,GSH既可由于污染 的暴露而产生适应性诱导反应,也可由于污染物 ?如加:2m 口0j0占一A1苗《 珊鲫姗伽 }{?0 一一, ?????O瑚瑚啪?o -I0占一A1《 一目.n一,掣呈{景0 与uj0占《 一.fl一,掣呈{号u 第3期聂湘平等:诺氟沙星(Nortloxacin)对蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)生 长及抗氧化酶活性的影响331 的毒性作用而产生中毒反应,导致生物体内GSH 含量降低.小球藻经过96h的短期暴露,GSH含量 总体处于诱导状态,但当NFLX浓度达到60mg?L 时其含量并没有显着增加,说明藻体内GSH在低浓 度NFLX暴露下产生了适应性诱导. CAT也是植物体内一种重要的抗氧化酶,它 能催化H20生成HO与O,以减轻HO对细胞 的氧化损伤.在低浓度NFLX作用下,CAT活性受 到明显诱导,并随着NFLX浓度的增大而逐渐升 高.但当NFLX浓度超过30mg?L时小球藻CAT 活性又逐渐受到抑制.本实验中CAT呈现出低浓 度诱导,高浓度抑制现象,在一萘酚对普通小球 藻的实验中也有类似的现象(彭金良等,2001). 当NFLX浓度超过了藻细胞的耐受极限,CAT不 足以消除小球藻体内产生的HO,从而引起自由 基的积累,导致各种酶活性下降甚至失活,藻细胞 生长受到明显抑制. 目前有关污染物对藻细胞中EROD影响的研 究还很少.但污染物对动物细胞EROD的影响研 究表明,一些污染物如PCBs,PAHs等会诱导 EROD的活性(王咏等,2000;徐镜波等,2003;王 菊英等,2003);也有研究表明喹诺酮类抗生素恩 诺沙星通过产生一些具有亲电子活性的中间产物 会诱导鱼类生物体内EROD的活性(Vaccaroet a1.,2003).但在哺乳动物研究中,多数研究结果 表明喹诺酮类抗生素可对细胞色素CYP1A1依赖 的EROD酶活性产生明显的抑制作用.本实验中, NFLX对EROD活性没有表现出明显的抑制作用, 甚至还在低浓度(15mg?L和30mg?L)时呈现出 微弱的诱导作用,说明小球藻体内EROD对喹诺 酮类药物NFLX的反应不敏感.另外,有研究指 出,实验温度,测试的生物种类属性以及暴露时间 的长短等均会对EROD的活性产生影响(陈加平 等,1999).因此,关于藻细胞EROD对抗生素药物 暴露响应的具体机理还需进一步探究. 通讯作者简介:聂湘平(1966一),新疆阿尔泰人,博士, 副教授,主要从事生态毒理学研究,发表 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 30余篇. 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