正交试验法优选乌拉尔甘草总黄酮提取工艺研究

正交试验法优选乌拉尔甘草总黄酮提取工艺研究 [摘要]:目的:用正交法研究提取甘草中的甘草总黄酮类化合物最佳提取工艺。方法:选取乙醇浓度、提取时间、提取温度、料液比及提取次数进行单因素试验，采用正交法，以甘草总黄酮类化合物得率作为检测指标。结果:经过正交试验得出的最佳工艺条件为:乙醇浓度80%，料液比1:20，提取时间2h，提取温度70?，回流提取次2次。结论:该方法提取率高，稳定性好，操作简便，适合工业化生产。 关键词:甘草 总黄酮 正交试验 提取工艺 吸光度 正交试验法优选乌拉尔甘草总黄酮提取工艺研究 [摘要]:目的:用正交法研究提取甘草中的甘草总黄酮类化合物最佳提取工艺。方法:选取乙醇浓度、提取时间、提取温度、料液比及提取次数进行单因素试验，采用正交法，以甘草总黄酮类化合物得率作为检测指标。结果:经过正交试验得出的最佳工艺条件为:乙醇浓度80%，料液比1:20，提取时间2h，提取温度70?，回流提取次2次。结论:该方法提取率高，稳定性好，操作简便，适合工业化生产。 关键词:甘草 总黄酮 正交试验 提取工艺 吸光度 甘草为双子叶植物豆科甘草，胀果甘草， 或光果甘草的根及根茎。始载于《神农本草经》，列为上品。甘草性平，味甘，归十二经。有解毒、祛痰、止痛、解痉以至抗癌等药理作用。在中医上，甘草补脾益气，滋咳润肺，缓急解毒，调和百药。临床应用分“生用”与“蜜炙”之别。生用主治咽喉肿痛，痛疽疮疡，胃肠道溃疡以及解药毒、食物中毒等;蜜炙主治脾胃功能减退，大便溏薄，乏力发热以及咳嗽、心悸等。甘草是我国传统常用中草药之一，也是我国重要的植物资源[1]。甘草黄酮类成分是甘草中最重要的活性成分之一，具有抗氧化、抗肿瘤、增 第1页 强心血管功能、增强免疫力等作用[2-5]。 1(仪器与试剂 2 材料与方法 3 结果与分析 4 结论与讨论 2.1 材料 乌拉尔甘草，粉碎，待用。对照品，芦丁。 乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等，均国产分析纯试剂。 2.2 仪器 FZ102五星植物试样粉碎机(北京永光明医疗仪器厂)、DZKW-4型双列六孔水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司)、T6新悦-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)、SHB-3循环水多用真空泵(郑州杜甫仪器厂)、FA1604N电子天平(上海精科仪器厂)、回流装置、圆底烧瓶、烧杯、滤纸、玻璃棒、滴管等。 3.方法与结果 3.1 总黄酮的含量测定 以芦丁为标准品，利用紫外分光光度法测定待测样品总黄酮含量。[6~8] 3.1.1 对照品溶液的制备 称取芦丁对照品10 mg，用95%的乙醇溶解，摇匀，定容至10 ml，使之成为浓度为1 mg/ml的芦丁标准品溶液，作为贮备液备用。 3.1.2 供试品溶液的制备 称取乌拉尔甘草若干，粉碎，过40目筛，称取粉碎样2.0g，置于250ml平底烧瓶，采用乙醇回流法提取(提取溶剂为80%乙醇、液料比为1:20、提取温度为70?、提取时间为2h、提取2次)。提取液抽滤、转至25ml容量瓶，定容，摇匀，待测。 3.1.3 比色原理及最大吸收波长选择 乌拉尔甘草含多种黄酮类化合物，其黄酮母核所含的游离羟基在适当的介质条件下能与金属铝离子形成络合物而显色。用一定浓度的亚硝酸钠溶液、硝酸铝溶液、氢氧化钠溶液显色，于450-550nm处扫描，对照品和供试品溶液的吸收光谱均在510nm处有最大吸收，因此测定波长选择510nm。 3.1.4 标准曲线的制备 称取芦丁对照品10 mg，用30%的乙醇溶解，摇匀，定容至10 ml，使之成为浓度为1.00 mg/ml的芦丁标准品溶液，作为贮备液备用。 第2页 量取上述溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 ml，分别加水至3 ml，加5%亚硝酸钠溶液0.5 ml，放置6 min，加10%的硝酸铝溶液0.5 m1，摇匀、放置6 min后加5%的氢氧化钠溶液2.5 m1，混匀、放置15 min后蒸馏水定容至10 ml,放置15min。用紫外分光光度计在500 nm处测吸光度，以对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标做标准曲线。 芦丁对照品标准曲线 0.07 y = 0.0799x + 0.0001 0.062 = 0.9998R0.05 芦丁浓度0.04 线性 (芦丁浓度)0.03吸光度 0.02 0.01 0 00.20.40.60.8 芦丁浓度 图1 芦丁标准品标准曲线 3.1.5 供试液总黄酮含量的测定 分别量取待测液1ML置10ML的容量瓶，按标准曲线项下操作显色，测定吸收度，利用吸光度及回归方程计算各样品总黄酮百分含量(T)计算公式为:T=C(mg/ml)*N*V(ml)/W(mg)*100% N为样品稀释倍数;V为提取液定容体积;W为样品质量。 3.2单因素试验与结果 3.2.1乙醇浓度对提取率的影响 准确称取粉碎样2.0g(5份)，置于250ML平底烧瓶，分别加入50%，60%，70%，80%，90%乙醇40ml,采用乙醇回流法提取(提取温度为70?，提取时间为2h，提取2次)。提取液抽滤，转至50ml容量瓶，定容，测定，计算提取率。结果见图2。 提取率 600.00% 500.00% 400.00% 提取率300.00%提取率 200.00% 100.00% 0.00% 5060708090 乙醇浓度 第3页 图2 乙醇浓度对提取率的影响 从图2中可以看出，乙醇浓度为80%时，提取率达到最高。在试验中，随着乙醇浓度(50%~90%)的增加，总黄酮提取率显著下降，可能是因为乙醇浓度的增加导致溶液粘度增加，影响了黄酮类化合物的浸出。因此，乙醇浓度以80%为宜。 3.2.2提取时间对提取率的影响 准确称取粉碎样2.0g(15份)，置于250ml平底烧瓶，分别加入80%乙醇40ml70?回流提取1h,1.5h,2h,2.5h。提取液抽滤，转至50ml容量瓶，定容，测定，计算提取率。结果见图3。 提取率 560.00% 540.00% 520.00% 提取率500.00%提取率480.00% 460.00% 440.00% 420.00% 1h1.5h2h2.5h 提取时间 图3 提取时间对提取率的影响 从图3可以看出，当提取时间为2.0h时，提取率达到最大值。此后在延长提取时间时，提取率缓慢下降，因此，提取时间以2.0h为宜。 3.2.3提取温度对提取率的影响 准确称取粉碎样2.0g(15份)置于250ml平底烧瓶，加入80%乙醇40ml分别于60?，70?,80?，90?的水浴中回流提取2.0h。提取液抽滤，转至50ml容量瓶，定容，摇匀，测定，计算提取率。结果见图4。 提取率 600.00% 500.00% 400.00% 提取率300.00%提取率 200.00% 100.00% 0.00% 60?70?80?90? 提取温度 图4提取温度对提取率的影响 从图4可以看出，随着温度(60~70?)的升高，提取率呈上升趋 第4页 势，这是因为温度的升高，加快了分子的扩散能力[9 10]。当温度为70?时，提取率达到最大值。温度在提高时，可能高温引起了黄酮类物质的变质，提取率反而下降。因此，提取温度以为70?为宜。 3.2.4料液比对提取率的影响 准确称取粉碎样2.0g(4份)，置于250ML平底烧瓶，分别加入80%的乙醇20ml,30ml,40ml,50ml,60ml采用乙醇回流提取法提取(提取为70?，提取时间为2h,提取2次)。提取液抽滤，转至50ml容量瓶，定容，摇匀，测定，计算提取率。结果见图5。 提取率 600.00% 500.00% 400.00% 提取率300.00% 提取率200.00% 100.00% 0.00% 1:101:151:201:251:30 液料比 图5 液料比对提取率的影响 从图5中可以看出，随着液料比的增大，黄酮的提取率也随着提高。当料液比达到1:20时，总黄酮溶出率基本达到高峰。继续提高料液比时，提取率增加不显著，因此，从经济角度考虑，料液比以1:20为宜。 3.3乌拉尔甘草总黄酮提取正交试验与结果 根据单因素试验结果，编制正交试验因素水平表。结果见表1。以 4总黄酮提取率为考察指标，L(3)正交表进行正交试验。结果见表1。9 方差分析结果见表2。 表1 正交试验 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 因素水平表 水平 A B C D 提取浓度(%) 固液比 提取温度(0C) 提取时间(h) 1 70 1:15 60 1.5 2 80 1:20 70 2 3 90 1:25 80 2.5 第5页 表2正交试验及结果 因素 A B C D 试验结果 (%) 乙醇浓度 固液比 提取温度 提取时间 试验1 1 1 1 1 67.56 试验2 1 2 2 2 333 试验3 1 3 3 3 115 试验4 2 1 2 3 449 试验5 2 2 3 1 187 试验6 2 3 1 2 83 试验7 3 1 3 2 122 试验8 3 2 1 3 95 试验9 3 3 2 1 283 均值1 171.853 212.853 81.853 179.187 均值2 239.667 205.000 355.000 179.333 均值3 166.667 160.333 141.333 219.667 极差 73.000 52.520 273.147 40.480 表3方差分析表 因素 偏差平自由度 F比 F临界值 显著性 方和 乙醇浓度 9954.552 0,281 4.460 0 料液比 4815.332 0.136 4.460 6 提取温度 123800.2 3.491 4.460 416 提取时间 3265.432 0.092 4.460 0 误差 141835.8 53 F0.05(2，2)=4.46 从表3中可以看出，对提取效果的因素依次为提取温度>乙醇浓 度>料液比>提取时间，提取温度与乙醇浓度有显著性差异。综合考虑， 确定各因素最佳水平组合为:提取时间2h,料液比1:20，乙醇浓度80%， 第6页 提取温度70?。 4结论与讨论 分光光度法是用来测定总黄酮含量的常用方法，此方法快速、稳定、适于生产工艺过程中的产品检测。正交试验法用于提取工艺优化，减少试验次数，节约成本，是天然产物有效成分提取工艺优化的良好工具。本研究采用分光光度法进行含量的测定，采用正交试验进行工艺的优选，得出乌拉尔甘草总黄酮提取优选工艺是:采用乙醇回流提取法，提取时间为2h,料液比1:20，乙醇浓度80%，提取温度70?。 黄酮类化合物具有多个苯环和酚羟基结构，苯环为非极性集团(疏水基团)，而酚羟基为亲水集团，具极性，所以用于提取黄酮类化合物的溶剂。应为具一定碳链长度的极性混合溶剂[11]，较低浓度的乙醇溶液符合此条件，表明本研究结论符合理论依据。 参考文献: [1] 王晓荣.榆林地区甘草资源的开发与利用[J].资源开发与市场,2003,19(6):402,414. 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