【doc】系统化细菌鉴定方法的探索及其启示

【doc】系统化细菌鉴定方法的探索及其启示 系统化细菌鉴定方法的探索及其启示 医学与哲学2005年l2月第26卷第l2期总第299 系统化细菌鉴定方法的探索及其启示 王庆飞03徐栋 摘要:细菌鉴定有着悠久的历史.随着现代科学技术的快速发展,许多新方法,新技 术在细菌鉴定中广泛应用,大大提高了 鉴定水平.细菌鉴定技术的发展历程,引发我们探索系统化细菌鉴定的新方法,并 带给我们对认识事物,看待问题,进行科 学思维,继承与创新等方面的哲学思考. 关键词:细菌鉴定;rRNA;PCR;哲学 中图分类号:R一02;R446.5文献标识码:A文章编号:1002—0772(2005)12—0050 —03 TheExploringandPhilosophicThinkingOnMethodofSystematizedBacterialIdentificationWANGQing-fei.XUDong.De. partn~.ntofPreclinicalMedicine-CollegeofMedicine.ZhejiangUniversity-Hangzhou310031-China Abstract:Identificationofbacteriahasalonghistory.Withtherapiddevelopmentofmodemscienceandtechnology.agreatmany novelmethodsandtechniquesareappliedinthefieldofidentification.whichmakesanenormousimprovementontheidentification ofbacteria.However.thedevelopmentalcourseofbacterialidentificationleadsUStoexploreanewwaywhatiscalledsystematized bacterialidentification.Andourphilosophicthinkingsaboutrealizingthings.1ookingonproblems-scientificthought.inheri. tanceandinnovationarearising. KeyWords:bacterialidentification;riix~somalRNA;FCR;philosophy 细菌的检测和鉴定在临床医学及基础医学研究中 都有着重要作用.随着现代科学技术的快速发展,许多 新方法,新技术在细菌鉴定中广泛应用,大大提高了检 测和鉴定水平,扩大了人类对疾病认识的广度和深度. 目前,细菌鉴定研究朝着简便,快速,精确,敏感的目标 不断深入.细菌鉴定技术的发展历程,引发了我们许多 方面的思考,带给我们深刻的启示. 1细菌鉴定方法和技术的发展 1.1传统方法的发展历程 1673年,荷兰科学家列文虎克(A.Leeuwenhoek) 用自己制造的显微镜发现了细菌,原虫等,开创了微生 物学.1876年,缪勒(Muller)对细菌进行了分类.微生 物方法学和医学微生物学的奠基人,德国医生科赫(R. Koch)发明了细菌染色法和动物试验,并发明了固体培 养基,为细菌的纯培养创造了条件;1877年,他出版了 《细菌学检查法》.1884年,丹麦细菌学家革兰(C. Gram)发明了经典的革兰染色法.以上这些方法学的 建立,推动了微生物学的发展,在此后短短的十几年里 发现了许多致病菌.科赫(R.Koch)由于对结核菌的发 现和在结核病方面研究的杰出贡献,荣获了1905年的 诺贝尔医学和生理学奖.1896年,格鲁伯(M.Gruber) 及肥达(F.wida1)发现了伤寒凝集反应并建立了伤寒凝 集试验.伴随随着微生物学,生物化学,免疫学的发展, 20世纪30年代,以直接涂片,染色,培养为核心的临床 细菌学形成….60年代发展起来的细菌鉴定方法主要 利用手工配制的试管培养基测定细菌的生化反应,来鉴 定细菌的种属. ?浙江大学医学院基础医学系浙江杭州3l003l ?浙江大学医学院附属第二医院肿瘤研究所浙江杭州 310009 1,2自动化仪器在细菌鉴定中的发展应用 为了达到快速,准确的鉴定细菌,在手工涂片染色, 分离培养,生化反应的基础上,50年代后期,国外开始 研制自动化细菌分析技术和仪器.70年代后,微生物 学家和工程技术人员根据细菌的不同生物学性状和代 谢产物的差异,逐步发展了微量快速培养基和微量生化 反应系统.80年代以来,由于计算机的广泛应用以及 分析软件的开发,出现了半自动化或全自动化的细菌鉴 定系统2,增加了细菌鉴定的种类,并使临床细菌鉴定 简易化, 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 化和商品化.目前应用较多的自动化鉴定 系统有:Vitek—AMSLrjl,Biolog【4.,Microscan【_2l,Sensi— titte[]等. 1.3分子生物学技术在细菌鉴定中的开展 随着分子生物学技术的发展及其在细菌鉴定中的 渗透和应用,细菌鉴定更加简便,快速,准确.尤其是以 聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)技术为 基础的细菌核糖体基因(rRNA基因)检测分析,如16S rRNA序列J和16S23SrRNA问区序列分析法, 给细菌鉴定开辟了新的途径.16SrRNA基因内部结 构由可变区和保守区组成:保守区为所有细菌所共有, 细菌问无差别,有"分子化石"之称;可变区在不同细菌 之问存在不同程度的差异,具有属或种的特异性.目 前,大多数致病菌的16SrRNA基因都已测序完成【, 为细菌的基因诊断提供了条件.16S,23SrRNA间区 序列分析法可为16SrRNA序列分类系统提供有力的 补充. 2分析,归纳,综合——系统化细菌鉴定方法的探索 单一的每种鉴定方法都有其优点和不足.常规鉴 定法(如分离培养,生化反应)操作复杂,所需时问长, 特异性不强;血清学试验容易出现交叉反应,不能区分 亚型;细菌自动化鉴定适于快速鉴定,但目前数据库中 Ivl~licineandPhilosophy,Dec2005.Vol26.No.12.TotalNo299 医学与哲学2005年12月第26卷第l2期总第299期 模式菌种数量有限,部分细菌只能鉴定至属,而且对 革兰阳性菌和厌氧菌的鉴定效果较差.分子生物学技 术可以从基因水平鉴定细菌种属,但所需试剂和仪器昂 贵,专业性强,适于科研上的细菌分类研究,目前不适于 基层和临床细菌的快速鉴定.因此,我们应在分析传 统方法,自动化仪器和分子生物学技术各自特点的基础 上,归纳综合,优势互补,探索系统化细菌鉴定方法,以 进一步简化临床及科研中的细菌鉴定过程. 董 图l系统化细西鉴定流程 图1是我们探索制定的系统化细菌鉴定流程.形 态和染色反应是最基础的.对检验的细菌,一般先直接 涂片进行革兰染色,明确染色性和细菌形态,可以缩小 鉴别范围,并为进一步鉴定提示方向.有些细菌结合临 床标本来源还可快速诊断.如泌尿生殖道标本涂片中 见到典型肾形的革兰氏阴性双球菌,可诊断为淋病;痰 菌中见抗酸杆菌可诊断结核等.革兰阳性菌或阴性菌, 阳性球菌或杆菌,阴性球菌或杆菌可以决定采用何种鉴 定系统.革兰阴性杆菌需进一步做氧化酶试验,革兰阳 性球菌要做触酶试验,依据上述试验结果,选择相应的 鉴定卡. 除少数细菌能根据染色性和形态明确鉴定外,绝大 多数需进一步培养.细菌分离培养是鉴定的重要技术, 自动化仪器再先进也只能对纯菌做出鉴定.在培养过 程中,细菌对营养,温度,酸碱度的要求,细菌的耐盐性, 生长繁殖特性,菌落,色素,溶血性,气味等特征是鉴定 的重要依据.需氧菌,兼性厌氧菌和厌氧菌通过常规培 养方法容易区别. 细菌染色性,形态特征,生化反应特征,血清学试验 等仍不能明确鉴定的情况下,应选择16SrRNA基因 PCR鉴定系统(对脑脊液,尿液等标本不需分离培养, 可直接PCR).根据设计的16SrRNA基因引物,对 16SrRNA基因进行PCR扩增,然后可选用探针杂 交【,直接测序8,限制性片断长度多态性(RFLP)[] 分析等,在基因水平上明确细菌的种属. 3启示 3.1科学的继承与创新:既要发展现代技术,也要吸收 MedicineandPhilosophy.Dec2005.Vo1.26.No.12.TotalNo.299 传统方法 继承是科学连续发 "创新是科学发展的必然要求, 展的纽带"[10].创新既着眼于原有的基础,又有所提 高.各种细菌具有不同的酶系统,对营养物质的利用存 在差异,应用生物化学方法检测细菌的代谢产物,有助 于种属的鉴定,但原有的手工操作繁琐,所需时间长,且 误差较大.基于这一情况,微生物学家和工程技术人员 根据生化试验鉴别细菌的原理,结合计算机自动读数记 录和软件分析等技术,开发出了自动化的细菌鉴定系 统,推动了细菌鉴定的发展.继承是科学发展的前提, 而创新才是科学发展的目的.创新的内容和形式是多 样的,但始终离不开充满生机与活力的创新思维.在继 承中创新,能使科学不断的扩大,加深和发展. 3.2认识到问题的普遍性与特殊性,善于抓住问题的 关键 PCR自1985年问世以来,以其灵敏性,特异性和 快速性在医学分子生物学领域得到广泛的应用,但普通 的PCR方法仅能对特定的病原菌进行检测,若病原菌 未明,要用到不同引物PCR,费时费力,使PCR应用于 病原菌的鉴定受到限制.分子生物学家为何要选取 16SrRNA或16S23SrRNA问区进行细菌鉴定呢? 这里有普遍性与特殊性的问题.16SrRNA基因由可 变区和保守区组成,保守区为所有细菌所共有,各种细 菌间无差别;可变区在不同细菌之间存在不同程度的差 异,具有属或种的特异性.16S,23SrRNA基因区间 是位于16SrRNA基因与23SrRNA基因之间的区间 序列,具有保守性和可变性.同一菌种的不同菌株,其 区间序列同源性至少在87%以上,一般在93%左右, 且序列长度变异小于2%,具有更好的种特异性l11J. 在保守区设计通用引物,通过对扩增产物的进一步分 析,早期快速检测病原菌存在与否,并可明确鉴定,从而 及时准确地对疾病进行诊断治疗.因此,科学工作者要 很好地了解所研究问题的普遍性与特殊性,掌握普遍 规律,针对特殊性提出问题,解决问题或提出新问题,将 科学研究不断推向前进. 3.3要用系统的,发展的,联系的眼光看问题 由于细菌种类颇多,其生物学性状复杂,要鉴定一 种细菌,确定其科,属,种,型,往往不能仅凭一种鉴定方 法就得出最终结论,而是要系统综合几种方法的结果, 才能得出最后的结论.目前各学科相互渗透,融合,多 学科的交叉日益增多,极大推动了科学技术的发展.细 菌鉴定方法和技术的发展,涉及微生物学,生物化学,免 疫学,分子生物学,计算机科学等多门学科,是多学科, 多层次,多方位系统研究综合的成果.细菌鉴定水平的 发展提高,为人类研究感染性疾病的发生,发展,诊断和 治疗,从本质上掌握疾病的规律起着非常重要的作用. 参考文献: [1]刘人伟.检验与临床[M].北京:化学工,l出版社,20吆.(下转第65页) 医学与哲学2005年12月第26卷第12期总第299期 制有了较深入的认识.虽然,胞外体疫苗在一系列l临床 前期实验中,取得了令人鼓舞的免疫治疗效果,但如果 想作为一种免疫治疗策略普及应用于l临床,还有许多问 题亟待解决,如胞外体疫苗的安全性,有效性以及如何 提高其免疫原性等问题.随着该领域研究的深人及其 边缘学科的崛起,解开了一些疑端的同时,势必会有一 些新的问题又现端倪,正是这种出现问题一解决问题一 再出现问题一再解决问题的曲折的前进过程,推动了这 个领域向着更深,更广的方向发展.小中见大,见微知 着,有理由认为,胞外体疫苗作为一种新型的免疫治疗 措施,具有较高的研究价值和广阔的开发前景. (*导师,通讯作者) 参考文献: 『1]ZITVOGELI,REGNAULTA.LOZIERA.eta1.Eradicationofes— tablishedmurinetumorsusinganovelcell—freevaccine:dendriticcell — derivedexosomes[Jj.NatMed,1998,(4):594—600. 【2jW()LFERSJ,LOZIERA,RAPOSOG,eta1.Tumor—derivedexo- somesareasourceofsharedtumorrejectionantigensforCTL crosspriming[J].NatMed,2001,7:297—303. [3]DENZERK,KLEIJMEERMJ,HEIJNENHF,eta1.Exosome: frominternalvesicleofthemultivesicularbodytointercellularsignaling device[J].JcellSei,2000,(113):3365—3374. [4]ST00RV0GELW,KLEIJMEERMJ.GEUZEHJ,eta1.Thebio— genesisandfunctionsofexosomes[J].Traff;c,2002,(3):321—330. 15jTHERYC,ZITVOGELL,AMI(X)RENAS.Exosomes:comwM— tion,biogenesisandfunction[J].NatRevImmunol,2002,(2):569— 579. [6]KATZMANNDJ,0D0RIZZIG,EMRSD.Receptordownregulation andmultivesicular—bodysorting.Nat.Rev[J].Mo1.CeIlBiol, 2002,(3):893—905. 【7jG0ULDSJ,X)1HAM,HILDRETHJE.TheTrojanexosome hypothesis[J].ProcNatlAcadSciusA,2003,16(100):10592— 10597. 18JCJAPULTN,TAiEBJ,SCHARTZNEC,eta1.Exosome—based irnmunotherapy[J].CancerImmunolImmunother.2004,(53):234 — 239. [9]sK0K()sD,LEPANsEs,VILLAI,eta1.Mastcell—dependentB andTlymphocyteactivationismediatedbythe,secretionofimmuno— logicallyactiveexosomes[J].JImmunol,2001,(166):868—876. [10]HWANGI,SHENX,SPRENTJ.DirectstimulationofnaiveTcells bymembranevesiclesfromantigen—presentingcells:distinctmlesfor CD54andB7molecules[Jj.ProcNatAcadSciUSA,2003,(100):6 670—6675. [11]ANDR6F,SCHARTZNE,MOVASSAGHM,eta1.Malignanteffu. sionsandimmunogenictumorderivedexc6omes【Jj.Lancet,2002, (360):295—305. 【12jLAMPARSKIHJ,METHA-DAMANIA,YAOJY,eta1.Produc. tionandcbaracterizationofclinicalgradeexosomesderivedfromden— driticcells[J].JImmunolMeth,2002,(270):211. 【13jANDREF,CHAPUTN,SCHARqNE,eta1.ExosomesasPotent CeIl—FreePeptide—BasedVaccine.I.DendriticCeIl—DerivedExo. somesTransferFunctionalMfHCClassI/PeptideComplexestoDen. driticCells[J].JImmunol,2004,(172):2126—2136. [14]cHAPLrrN,SCHARTZNE,ANDREF,eta1.ExosomesasPotent Cell—FreePeptide一13&sedVaccine.II.ExosomesinCoGAdjuvants EfficientlyPrimeNaiveTc1LymphocytesLeadingtoTumorRejection lJj.JImmunol,2004,15(172):2137—2146. 【15]ANGEVINE,ESCUDIERB,LANTZO,eta1.ImmunotherapytLsing dexosomeslcadedwithmage一3peptides(A1/t335andDP04):re. suitsofthefirstD}laseIstudyinadvancedmelanomapatients.7thInter— nationalSymlxx4iumonDendriticCells.2002.28. 【16jNGUYENDG,BOOTHA,GOULDSJ,eta1.EvidencethatHIV buddinginprimarymacmph~esoccursthroughtheexosomerele&~,e pathway[J].JBiolChem.2003,(278):52347—52354. 117jDUKERSDF,MEIJP,VERVCK)RTMB,eta1.Directimmunosup. encodedlatentmerllbrarleprotein1【J].JIm. pr~ssiveeffectsofEBV— munol,2000,(165):663—670. 【18jFLANAGANJ,MIDDELD()RPJ,SCULLEYT.Localizationofthe Epstein—BarrvirusproteinLMP1toexosomes[J].JGenVirol, 2003,84(Pt7):l871—1879. 作者简介:牟丹蕾(1973一),女,山东省日照人,博士研究生,现从事感染 性疾病致病机制的研究. 收稿日期:2005—05—31 修回Et期:2005—08—20(责任编辑:王德顺) (上接第51页) [2]刘锡光.现代诊断微生物学[M].北京:人民卫生出版社,2002. [3]王奕峰,陆广珍,胡培玉.VITEK—AMS自动微生物检测系统的应 用[J].上海预防医学,2000,12(2):82—83. 14JHOLMESB,COSTASM,GANNERM,eta1.Evaluationofbiolog systemforidentificationofsomegram一'negativebacteriaofclinicalim— portance[JJ.JClinMicmbiol,1994,8:1970—1975. 【5jRANTAKOKKOJK,NIKKARIS,JALAVAJ,eta1.Directamplifi— cationofrRNAgenesindiagnosisofbacterialinfections[J].JClinMi— cmbiol,2000,38:32—39. [6]GONZALEZN,ROMEROJ,ESPEJORT.Cemprehensivedetection ofbacterialpopulationsbyPCRamplificationofthe16S一23SrRNA spacerregion[J].JMicrobiolMethods,2003,55(1):91—97. 17JSHANGS,CHENZ.YUX.DetectionofbacterialDNAbyPCRand reversehybridizationinthe16SrRNAgenewithparticularreferenceto neonatalmpticemia[JJ.ActaPaediatr.2001,90(2):179—183. Ideclieirmand~iloso0tr/.Dec2005.Vol26.No.12.TotalNo299 【8jKOTILAINENP,JALAVAJ,MEURMANO,eta1.Diagnosisof meningococcaleningitisbybroad—rangebacterialPCRwithcere— bmspinalfluid[J].JClinMicmbiol,1998.36(8):2205—2209. 19jLUJT,PERNGCL,LEESY,eta1.UseofPCRwithuniversal primersandre~strictionendonucleasedigestionsfordetectionandidenti— ficationofcomnqonbacterialpathogensincerebrospinalfluid[J].JClin Microbiol.2000,38(6):2076—2080. [10]刘奇,贺新华.自然辨证法概论[M].北京:北京医科大学出版社, 2000. 【l1jNATHALIELB,HERVEP,IRENEM.eta1.16SrRNAand16Sto 23Sintemaltranseribedspacersequenceanalysisrevealinterandin— traspecificBifldobacteriumphylogeny[J].IntJSysBacteriol,1996,46 (1):102一l11. 作者简介:王庆飞(1983一),男,浙江义乌人,浙江大学医学院基础医学 系2o01级学生. 收稿日期:2005—06—07(责任编辑:王德顺) 65