人骨髓间充质干细胞的培养与鉴定CultivationandIdentificationofHumanBoneMarrowMesenchymalStemCellsHUANGMei-juan(QingdaoCentralHospital,Qingdao266042,Shandong,China):ObjectiveToisolateandculturehumanbonemarrowderivedmesenchymalstemcells(hBMSCs,andtoobservebiologicalcharacteristicsofhBMSCs.MethodsBonemarrowmononuclearcellswereseparatedbythemethodofdensitygradientcentrifugationandMSCswereobtainedbyadhereculture.Thecellmorphologyandtheirgrowthcharacteristicsinvitrowereobservedunderaninvertedphasecontrastmicroscopeandthecellcyclesweretestedbyflowingcytometry.Mesenchymallikestemcellswereidentifiedbysurfacemarkerwithflowcytometry.ResultshBMSCswereadheredlikeafibroblastmorphologyandwithpoollikegrowthalinement.FlowcytometryshowedthatthethirdpassagecellswerepositiveforCD73CD90andCD105expression.ConclusionTheMSCsfrombonemarrowinthisstudyshowgreatcapabilityofproliferation.间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSCS是来源于中胚层的具有多向分化潜能的干细胞.骨髓是MSCSt勺主要来源之一,由于其获取途径的便利和对组织损伤小等优点而格外受到重视.从成人骼棘处别离出的MSCSX占骨髓中单个核细胞的1/106〜1/105;但在体外可以别离培养和大量扩增,并能保持细胞
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型和多系分化潜能稳定.为了了更好地利用MSCs本钻研发展了一种简便有效的从成人骨髓别离纯化MSCS勺方法.1材料与方法1.1主要试剂及仪器DME俯养基,10%台牛血清（FBS,Hyclone公司）；25cm细胞培养瓶（Coning公司）；胰蛋白酶、荧光标记小鼠抗人CD34和CD45表达阴性,CD73CD9铮口CD105（Sigma公司）；人淋巴细胞别离液（1.077g/ml,天津TBD公司）；流式细胞仪、离心机（Beckman公司）；550型酶标仪（BIO-RAD.1.2抽取骨髓和别离间充质干细胞骨髓来源于本院非血液病患者,无菌抽取5ml骨髓液并肝素化,与等量体积、含10%台牛血清的L-DME晞养液混匀,置于Ficol1别离液（比重1.077）上,2000r/min离心20min,离心后搜集白膜层中的单个核细胞,以含10%FBS勺L-DME瞻养液重悬细胞并进行计数,以1X106/ml的密度接种于25ml的培养瓶中,置于37C、体积分数5%勺CO2培养箱孵育.24h后全量更换培养基以弃去非贴壁的细胞,此后隔天或视细胞生长状态进行半量换液.细胞融合达80吩90%寸,予0.25%胰蛋白酶和EDT用肖化液消化回收,按1:2〜1:3的比例传代,倒置相差显微镜下每天打量细胞生长情况.1.3BMSC缺面标志检测取第3代细胞0.25%胰酶消化,离心,PBSa涤收获细胞,计数调整细胞密度为了5X106/ml,取100Vl细胞悬液分别与CD34CD45CD73CD9QCD105单克隆抗体室温闭光反响30min,用洗涤液洗涤2次,离心,送流式细胞仪检测外表标记.1.4hMSCs生长曲线的绘制P3代细胞使用胰酶消化,按1X107/ml密度接种于96孔培养板中,每孔培养液为了100M.每24h取细胞各6孔,MTI"比色法测各孔光密度值（490nm,以时间为了横坐标、OD直为了纵坐标绘制细胞的生长曲线.2结果2.1hBMSC蛤离、培养情况hBMSCs接种48h后细胞贴壁,分裂增殖.此时换液去除悬浮杂细胞.72h后细胞逐渐呈梭形,细胞核居中,可见1〜3个核仁.7d后形成多个克隆,约2周细胞融合成单层,呈特征性漩涡状,胞浆淡染,核染色质粗.传代后24h细胞贴壁,成梭形,迅速增殖.7d可铺满培养瓶底.传代后细胞得到纯化,梭形细胞达98如上.在10代后可打量到hBMSC薛外分化潜力降低.20代后hBMSC#外增殖水平明显衰退,细胞变扁平、增大,失去原成纤维样结构,出现衰老迹象,所以我们选用5代以内的细胞进行实验.hBMSCS^态学打量结果见图1〜2.图1hBMSC形态学打量（X40）图2hBMSCs形态学打量（X100）2.2hBMSC缺面标志物鉴定FCM佥测细胞样本,结果显示：CD34和CD45表达阴性,CD73CD90和CD105表达阳性,证实这些细胞是非造血系细胞.2.3hBMSC砂田胞增殖水平及生长曲线测定1〜3dhBMSCs增殖缓慢,3〜5d快速增殖,5〜7d趋于平缓,7〜9d呈下降趋势,见图3图3hBMSCs生长曲线3讨论间充质干细胞具有多向分化的水平和调节免疫作用,其在组织
工程
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和临床治疗中的广泛应用已获得了极大的关注.目前,MSCS勺培养方法主要有：组织别离法、密度梯度离心法、全骨髓贴壁法和免疫磁珠或流式细胞仪分选法[1〜3].密度梯度离心法利用骨髓中各种细胞的密度不同,通过密度梯度离心吸取单核细胞层进行培养,获得的细胞均一、纯度较高,且视野清晰,便于早期打量和定性细胞钻研.与造血系细胞不同,体外培养的骨髓来源的MSCSte够贴壁生长,尤其易粘附于塑料培养器皿底面生长增殖.因此,本文将骨髓单个核细胞接种到塑料培养皿进行培养,通过换液去除非贴壁细胞,以此来别离和纯化MSCs在细胞培养初期频繁换液,可以减少造血系细胞的混杂和粘附.换液时注意动作轻柔,以免大量丧失MSCs原代培养3d后,可见造血系细胞明显减少.在第14d移种贴壁细胞时,减少0.25%胰酶的作用时间,使MSC舰落并让底面尽可能多地保存造血系细胞.胰酶作用的时间和温度非常重要,如果时间和温度超过2min和25C,造血细胞会和MSCl起脱落.在第21d时细胞汇台铺满瓶底,都呈长梭状的成纤维细胞样形态.不同来源的MSC卧表型尚有争议,CD73CD9铮口CD105是目前比拟公认的MSC$a型分子［4,5］.本钻研别离纯化的第3代细胞高表达CD73CD90和CD10碍MSC亲面标志分子,同时低表达CD34和CD45等造血系细胞的外表标志分子,说明本钻研别离纯化的细胞群是不同于造血系细胞的处于未分化状态的原基质细胞.按本方法别离纯化的细胞具有MSC卧典型形态特征,细胞外表表达MSC邸］特征性标志,可为了体外钻研提供根底和条件.
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