琼脂糖凝胶电泳及PCR产物的回收纯化
实验三 琼脂糖凝胶电泳及PCR产物的回收纯化
一、实验目的
1、掌握琼脂糖凝胶制备方法
2、掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA方法
3、掌握PCR产物回收和纯化方法
二、实验原理
根据DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应,达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电,在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。
电泳过程中或电泳完毕,直接利用低浓度的荧光染料EB，溴化乙锭，进行染色,EB可以嵌入核酸双链的配对碱基之间,在紫外线激发下,发出荧光,既可以确定DNA条带在凝胶中的位置,而且灵敏度很高,少至1，10 ng的DNA条带即可直接在紫外灯下检出。
不同浓度琼脂糖凝胶分离的范围
凝胶中琼脂糖含线状DNA分子的有效分
量，%， 离范围，kb，
0.3 5，60
0.6 1 ，20
0.7 0.8 ，10
0.9 0.5 ，7.0
1.2 0.4 ，6.0
1.5 0.2 ，3.0
2.0 0.1 ，2.0
琼脂糖凝胶电泳后,用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化PCR产物。试剂盒中有一个特制的Column,将硅胶填充到这个特制的管中,利用硅胶在高盐低pH下,吸附DNA,在低盐和高pH条件下DNA可再被洗脱的原理, 进行DNA的回收和纯化。
此外还有玻璃奶，Glassmilk法，,冻融法等方法 回收纯化DNA。
三、主要实验仪器和试剂
主要仪器:
电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、水浴锅、微波炉、离心机等。 主要实验试剂:
1、50×TAE ，2 M Tris,1M 醋酸,50 mM EDTA，pH8.0，，
2、10×上样缓冲液，loading buffer，
3、分子量
标准
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DNA Marker
4、琼脂糖
5、EB ，溴化乙锭，，黑暗保存，
6、DNA回收纯化试剂盒，AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒，
四、实验步骤
琼脂糖凝胶的制备:
1、将洗净的电泳槽洗净,置于平整的台面上,并调节水平, 2、用1×TAE 电泳缓冲液配制0.8%的琼脂糖,微波炉加热使其溶解, 3、待琼脂糖溶液冷却至60?C左右时,加入EB，浓度约 0.025 ug/mL，,搅拌均匀。缓缓将琼脂糖倒入胶模中,厚度约5至7mm, 4、插入梳子,静待琼脂糖凝固,
5、将胶模放进电泳槽中,向电泳槽倒入1×TAE电泳缓冲液,没过胶约5mm,
6、小心拔掉梳子,用20 ul移液器吸取DNA溶液，20 ul DNA 加 2，3ul 10×loading buffer，,缓缓加入点样孔,并在最右边的点样孔加4 ul DNA Maker,
7、 接通电源,，注意电源的正负极;，电泳20，30分钟, 8、电泳完毕,关闭电源。从胶模中取出琼脂糖凝胶,置于紫外灯下观察。
PCR产物切胶回收:
1、在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，计算凝胶重量。(100mg凝胶，计100ul体积)(尽量缩短暴露UV灯下的时间～)
2、加入3个凝胶体积的Buffer DE-A(600 ul)，混合均匀后，于65?C 加热，直至凝胶完全熔化。
、加0.5个Buffer DE-A 体积的Buffer DE-B(300 ul),混合均匀，当分离3
的DNA片段小于400 bp时，加入1个凝胶体积的异丙醇。 4、吸取3中的混合液，转移到DNA制备管(置于2 ml 离心管中)，12，000× g 离心1 min。弃滤液。
5、将制备管置回2 ml离心管中，加500 ul Buffer W1， 12，000× g 离心30 sec，弃滤液。
6、将制备管置回2 ml离心管中，加700 ul Buffer W2, 12，000× g 离心30 sec，弃滤液。重复一次。
7、将制备管置回2 ml离心管中， 12，000× g 离心1 min。彻底去除残余的液体。
8、将制备管置于1.5 ml离心管中，在制备膜中央，加25,30 ul 65?C Eluent或去离子水，室温静置1 min。 12，000× g 离心1 min洗脱DNA。
思考题:
1、如何有效提高凝胶纯化PCR产物的效率,
2、琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响,
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