烟草淀粉酶活性与多酚氧化酶活性测定实验方案.doc

烟草淀粉酶活性与多酚氧化酶活性测定实验 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 .doc 烟草中淀粉酶活性与多酚氧化酶活性的测定 淀粉酶活性的测定 ，5-二硝基水杨酸还原理:根据淀粉酶水解淀粉产生的一系列还原性糖类可将3 原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，通过溶液颜色的深浅可反映出还原 性糖类的浓度，也就可以间接反映出淀粉酶的活性，因此，可以用比色法， 通过标准曲线测定淀粉酶的活性。 实验材料，仪器，试剂 (1).材料:烟草新鲜叶片组织 (2).仪器:a.分光光度计 b.离心机 c.恒温水浴锅 d.具塞刻度管 e.容量瓶 (3).试剂:a.标准麦芽糖溶液(1mg/ml);精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水 溶解，定容至100ml。 b.3，5-二硝基水杨酸(10mg/ml);精确称取1g3，5-二硝基水杨 酸，溶于20ml12mol/L的HONa溶液中，加入50ml蒸馏水，再加30g酒石 酸钾钠，待其溶解后用蒸馏水定容至100ml。 1,氯化钠溶液，称取5g氯化钠于500ml容量瓶中定容。 c. ,淀粉溶液;称取1g淀粉溶于100ml0.1ml/L的柠檬酸钠溶液 d(1 中。 实验步骤 (1).仪器药品的准备与配置;按实验需求，将所有实验中用到的器材(大型实验设备应进行检查，做好使用前准备工作)试剂准备好 a.器材包括称量用到的分析天平以及电子天平，溶解用到的容量瓶(100ml×;1000ml×2)，烧杯(包括100ml×5和500ml×1)，玻璃棒，量筒等，以及实验用的数支具塞刻度试管，将上述仪器洗净并用蒸馏水浣洗，同时检查分光光度计，离心机，恒温水浴锅等设备 b(按照要求将所需求的试剂按步骤配制好，贴好标签，待用 c(冷冻样品提前做好解冻工作 (2)(标准曲线的制作;取10支具塞刻度试管，分别编号，以1号为空白对照分别按下表加入相应试剂 编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 试剂 标准麦芽糖溶0 2 4 6 8 10 12 14 16 液(ml) 3,5-二硝基水杨2 2 2 2 2 2 2 2 2 酸溶液(ml) 定容至20m1 l00?水浴锅反应5min 之后取出用流水冷却，以1号试管为空白调零点，在540nm波长下比色测定2,10号试管的OD540值，以麦芽糖含量(浓度)为横坐标，各浓度下的OD值为纵坐标，用坐标纸绘制标准曲线，求出回归方程。 (3)(酶溶液的提取;将样品分别编号，按以下步骤分别操作 a(称取2g样品于研钵中，加入少许石英砂和2ml氯化钠溶液，研磨成匀浆; b.将匀浆转入离心管中，并用6ml氯化钠溶液分次洗涤研钵，将残渣一并洗入离心管内，于室温下放置15,20min，没隔数分钟搅动一次，使其充分提取 c(然后待全部样品按上述步骤完成后，一次性转入离心机内，以3000r/min的转速离心10min，将上清液到入100ml容量瓶中，定容，摇匀，贴上相对应于样品的编号，即为淀粉酶原液，依据实际情况做好保存工作，防止酶活性退化或酶失活 (4)(样品淀粉酶活力的测定;对于每个样品进行一下操作 取两支具塞刻度试管，编号为1和2，按下表加入以下试剂 试管编号 1 2 试剂 样品酶原液(ml) 2 0 100?水浴锅中煮 10min 样品酶原液(ml) 0 2 1,淀粉溶液(ml) 2 2 37?水浴锅中反应10min 3，5-二硝基水杨酸溶液(ml) 2 2 100?水浴锅反应5min 用蒸馏水定容至20ml，适当稀释后于540nm波长下测定OD值，以1号试管为 空白调零 分别对每个样品按上述(4)步骤进行检测，记录相关数据并计算结果，将数据汇总后做成表格， 其中样品淀粉酶活力=?C×V/(W×V×T)(mg/g/min)。式中，?C为从标准Ts 曲线上查得的麦芽糖含量(mg);VT为淀粉酶原液总体积(ml);Vs为反应所用淀粉酶原液体积(ml);W为样品重量(g);t为反应时间(min)。 对实验结果做出相应的分析和评价。 OD值 还原糖含量 酶活力样品编号 A=520.00 nm (mg/ml) (mg/g/min) WB-08 0.142 0.742 2.373 WB-11 0.170 0.919 2.941 WB-15 0.146 0.767 2.454 WB-19 0.243 1.381 4.420 WB-12 0.144 0.754 2.414 WB-18 0.214 1.198 3.832 WB-09 0.119 0.596 1.907 WB-13(1) 0.280 1.616 5.170 WB-16 0.155 0.824 2.637 WB-17 0.147 0.773 2.474 WB-13(2) 0.202 1.122 3.589 WB-20 0.257 1.470 4.704 WB-21 0.292 1.692 5.413 WB-10 0.154 0.818 2.616 烟草中多酚氧化酶活性的测定 原理:多酚氧化酶在有氧条件下会将酚氧化为醌，醌在525nm波长下有较强的吸光值，通过测定525mn下的吸光值变化可测得多酚氧化酶 材料，仪器，试剂 (1)材料:烟草叶片组织 (2)仪器:分光光度计 离心机 匀浆机 试管 吸量管 (3)试剂: a. 0.05mol/L PH=5.5的磷酸缓冲溶液 b. 0.1mol/L的儿茶酚溶液 c. 质量分数为20,的三氯乙酸 d. 不溶性聚乙烯吡咯烷酮(PVP) e. 质量分数为30,的硫酸铵 f.0.1mol/L ph=6.5的磷酸缓冲溶液 g.0.01 mol/L ph=6.5的磷酸缓冲溶液 实验步骤 (1) 实验设备和用品的准备;备齐实验所需器皿，洗净并用蒸馏水浣洗，检查 所用设备，做好使用准备工作，备齐实验所用试剂，按要求放置妥当。 (2) 酶液的提取;将所有实验材料进行分组编号，每组样品取2g，置于大研 钵中，用 5ml磷酸缓冲溶液，研磨均匀，并用5ml缓冲液洗涤研钵，转 入15ml离心管，4000r/min离心5min,取上清液加5ml质量分数为30, 的 硫酸铵，以4000r/min的速度离心15min，去沉淀，上清液转入40ml离 心管再加质量分数为30,的硫酸铵10ml， 4000r/min离心15min，收集 沉淀，将所得沉淀溶于1ml0.01mol/Lph=6.5的磷酸缓冲溶液中，粗制成 酶溶液，将所制酶溶液放于4?冰箱中保存，直至所有样品酶制剂都做完 成。 (3) 酶活性的测定;对于每一组酶制剂，分别做以下操作 试管编号 一号试管(设3次重复) 二号试管 试剂 磷酸缓冲液(ml) 3.9 3.9 儿茶酚(ml) 1 1 37?水浴10min 100?水浴10min 粗制酶制剂(ml) 0.1 0.1 37?水浴10min 100?水浴10min 将两支试管迅速放入冰水浴中，立即加入2ml的20,三氯乙酸，以5000r/min的转速离心10min，收集上清液，并适当稀释，于525nm波长下测定其吸光值。 按上述步骤测定每一组样品，记录OD值 (4) 酶活性的计算;以每分钟内OD525值变化0.01为一个酶活力单位计算，有下列公式 酶活性=?A?D/(0.01T) 酶的比活力=?A?D/(0.01T?W) 式中:A——反应时间内吸光值的变化; W——样品鲜重(g); T——反应时间(min); D——稀释倍数，即提取的酶的总酶液为反应系统内酶液体积的倍数。 计算每一组样品的最终测定结果，和实验数据一起做成表格，对实验结果作出分析评价。