【doc】蛋白核小球藻不同培养方式的比较

【doc】蛋白核小球藻不同培养方式的比较 蛋白核小球藻不同培养方式的比较 第26卷第5期 2005年l0月 河南工业大学(自然科学版) JournalofHenanUniversityofTechnology(NaturalScienceEdition) Vo1.26,No.5 0ct.2005 文章编号:1673-2383(2005)05--0052--04 蛋白核小球藻不同培养方式的比较 桂林,史贤明,李琳,胡松青,刘国琴 (1.华南理.32大学轻工与食品学院,广东广州510640; 2.上海交通大学食品科学与工程系,上海201101) 摘要:采用自养,异养,混养3种方式对蛋白核小球藻15—2070进行了培养.测定了3种培养方 式获得的生长曲线,最高生物量(千重)和最大比生长速率.对3种方式培养获得的藻细胞的化 学组分进行了 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 ,并比较了三者之间的差异. 关键词:蛋白核小球藻;自养;异养;混养 中图分类号:TS201.3文献 标识 采样口标识规范化 下载危险废物标识 下载医疗器械外包装标识图下载科目一标识图大全免费下载产品包装标识下载 码:B 0前言 小球藻(Chlorella)为绿藻门小球藻属的普生 性单细胞藻类,包括约十个种,常见的有蛋白核小 球藻(C.pyrenoidosa),椭圆小球藻(C.ellipsoidea), 普通小球藻(C.vulgaris)等….小球藻细胞中含丰 富的蛋白质,不饱和脂肪酸,生物多糖,膳食纤维, 氨基酸,维生素,微量元素及其他活性物质.具有 防治消化性溃疡,抗肿瘤,增强免疫力,抗辐射,防 治贫血,降血脂和抗动脉粥样硬化等保健功效,是 优质健康的绿色食品和良好的医疗保健品_2J. 从应用角度看,小球藻最初是作为单细胞蛋 白(SCP)资源进行开发利用,但其生长繁殖速度 比细菌和酵母慢,与这些单细胞生物竞争难以居 于优势,所以逐渐转向生产保健食品,美容食品和 食品添加剂,并进一步开发利用小球藻的有效成 分作为医药和生化制剂,这反映了目前小球藻应 ,从小球藻干粉中分离叶绿 用研究的方向.譬如 素,类胡萝卜素,作为天然色素原料;脱色后的藻 体再用于分离提取多糖,糖蛋白,小球藻生长因子 (CGF),氨基酸,ATP和核酸等物质,作为医药原 料,调味品,所以今后将会出现越来越多的小球藻 收稿13期:2005-06—14 基金项目:广东省关键领域重大突破项目(2003A30908);广东省科 技攻关项目(2003C104025);华南理工大学高水平大学建设项目 作者简介:桂林(1975一),男,湖北武汉人,l尊士研究生,主要研究 方向为食品微生物和生物化工. 制成的商品_3J. 小球藻除了可以利用光能和CO进行正常的 光合自养生长外,还可以在无光条件下利用有机 碳源和0,进行异养生长繁殖,生长速率比自养条 件下快得多,类似于细菌的发酵;以及在光照条件 下,利用有机碳源进行混养培养.由于小球藻这一 特性和其较高的应用价值,所以有关培养方式,转 化的机制,细胞结构的变化,生化成分和代谢调控 方面的研究尤为引人注目.但国内外的研究多集 中在异养方面,对混养机制的研究较少,特别是自 养,异养,混养三者之问的比较则几乎没有报道. 所以本研究把小球藻3种培养方式同时进行了比 较,以期为大规模商业化培养小球藻,充分利用这 一 宝贵资源提供科学依据和技术参考. 1材料与 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 1.1实验材料 蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)15—2070:由 CarolinaBiologicalSupplyCo.(Burlington,USA)提 供,用Basal培养基制成的固体斜面低温保存. Basal培养基[]:分为自养,异养和混养液体 培养基,组成见表1. 1.2实验仪器 舱式光照恒温摇床(NewBrunswickScientific co.,USA),照度计(北京师范大学光电仪器厂), 恒温干燥箱(武汉市武昌实验仪器厂),真空冷冻 干燥器(KarlKolbScientificTechnicalSupplies,Ger— manv),721型分光光度计(上海第三分析仪器 第5期桂林等:蛋白核小球藻不同培养方式的比较53 厂),微量凯氏定氮仪(湖北恒康化玻仪器公司), 索氏抽提器(湖北恒康化玻仪器公司),马福炉(河 南省鹤壁市热工仪器厂). 表1Basal培养基组成mg/L 1.3实验方法 I.3.I培养方式 采用自养,异养,混养3种培养方式对蛋白核 小球藻152070进行培养.用500mL三角瓶装 200mL液体培养基,121?灭菌20min,接种量 5%(/).同时放人舱式光照恒温摇床中,光源 在摇床内部,由6只40W日光灯管组成,连续光 照.自养和混养的三角瓶直接曝露在光照下,而异 养的三角瓶用3层黑色塑料袋包起来(露出棉塞 便于通气),使其不透光.用照度计测定摇床上各 点的光照强度,发现光强均匀,均为(4000?100) lx.然后开始恒温摇瓶培养,28?,转速150r/min, 每隔24h取样一次,每次5mL,测细胞干重(测定 方法见1.3.2).3种培养方式培养条件的不同之 处见表2,其余条件均相同. 表23种培养方式培养条件的区别 1.3.2细胞干重和最大比生长速率()的测定 取1mL藻液于已预烘干的离心管中,6000 r/min离心1min,弃去上清液,用吸水纸吸去管壁 表面附着的水分,把离心管敞口放人烘箱中,80 ?烘至恒重,测定干重.做3个重复,取其平均值, 得到细胞干重. 最大比生长速率()= 式中:l,2为对数生长期的细胞干重,g/L;tl,t2 为对应的培养时间,d. 1.3.3藻粉的制备 培养完毕后,收集培养液,6000r/min离心4 min,弃去上清液,收集藻泥,在真空冷冻干燥器中 干燥,把干燥后的藻体用研钵磨碎成藻粉,过60 目筛,放人密封容器中,一18?保存备用. 1.3.4藻细胞成分的测定 1.3.4.1水分含量的测定 常压烘箱干燥法5j.80?恒温烘至恒重. 1.3.4.2粗蛋白的i贝0定 微量凯氏定氮法_6j. 1.3.4.3粗脂肪的测定 索氏抽提法[.6j. 1.3.4.4粗灰分的测定 灼烧法l.6j. 1.3.4.5碳水化合物的测定 差减法_6j.碳水化合物(%)=100%一水分 (%)一粗蛋白(%)一粗脂肪(%)一粗灰分(%). 1.3.4.6抗坏血酸的测定 2,_--氯酚靛酚法_5j. 1.3.4.7叶绿素的测定lj 准确称取0.1g藻粉,加人少许CaCO,再加 入80%丙酮5mL,用细胞破碎器进行细胞破碎 (10000r/min,5min),离心(6000r/min,4min), 收集上清液;重复以上操作,直至提取液近乎无 色.收集所有提取液,用甲醇定容至100mL,以甲 醇为对照,测定663nm,645nm处的吸光值.根据 下列公式,计算叶绿素a,叶绿素b和总叶绿素的 含量.整个提取过程控制在30rain以内,并在弱 光下进行. C=(12.72A663—2.59A645)×100/(1000×W) Cb=(22.88A645—4.67A663)×100/(1000×W) C总(20.29A645+8.05A663)×100/(1000×W) 式中:c,C6,c总分别为叶绿素a,叶绿素b和总 叶绿素的含量,mg/g;A663,A645分别为提取液在 663nm,645nm处的吸光值;W为藻粉于重,g. 1,3.4.8叶黄素的测定 高效液相色谱法7j:Millennium2010色谱工 ),510 作站(采用美国Waters高效液相色谱系统高压泵,717自动进样器,996光二极管阵列检测 器,以甲醇一二氯甲烷(2:1,V/V)混合溶剂为叶 黄素提取剂,色谱柱为Nova.PakC.8柱,柱温 54河南工业大学(自然科学版)第26卷 25.C,以甲醇一乙腈一水(80:10:10,V/V/)和甲 醇一乙腈(40:60,V/V)为流动相,梯度洗脱,流速 0.8mL/min,进样量10L,在447nm下用光电二 极管阵列检测器检测. 2结果与分糯 2.13种培养方式的比较 采用自养,异养,混养3种方式培养蛋白核小 球藻15—2070,并在其生长过程中测定生物量等参 数,结果见图1和表3. ? 蚓 留 最 图13种培养方式的蛋白核小球藻生长曲线 表3蛋白核小球藻在3种培养 方式下的生长参数 注:":最大比生长速率 由图1和表3可知,蛋白核小球藻在自养条 件下生长极其缓慢,生物量增长不明显;而进行异 养和混养生长时生物量提高很快,异养和混养培 养的小球藻的最高生物量远大于自养时的最高生 物量,比生长速率分别是自养时的5.8倍和6.2 倍;并且混养生长的速度比异养生长则更快一些. 2.2以3种培养方式获得的藻细胞成分的比较 由3种培养方式培养蛋白核小球藻,获得干 藻粉,并测定细胞的主要成分,结果见表4. 表43种培养方式藻细胞成分的比较(干藻粉) 由表4可见,蛋白核小球藻具有很高的蛋白 质含量,而蛋白质含量与其生长方式和生长条件 有很大关系.自养方式得到的藻细胞蛋白质含量 最高,占到细胞干重的50%以上,但自养生长生 物量极低,蛋白质的总产量就很低;混养方式得到 的细胞蛋白质含量也比较高,但混养方式需要添 置光照设施,造价很高;而异养方式得到的细胞蛋 白质含量则低得多,只有自养的56%,导致这种 差异的原因在于异养(无光照)生长小球藻的代谢 方式和途径与自养生长,混养生长(有光照)相比 发生了很大的改变.从营养学角度来看,具有高蛋 白含量并不等于具有高营养性,还应具有平衡的 必需氨基酸.杨鹭生等l8J分析了蛋白核小球藻 (C.pyrenoidosa)的氨基酸组成,计算出其蛋白质 必需氨基酸指数为64.3.小球藻蛋白质的必需氨 基酸指数处于面粉,玉米和花生仁等植物蛋白质 这一等级. 蛋白核小球藻在不同的生长方式下脂肪含量 的差异也较大.异养细胞的粗脂肪含量是自养的 一 倍多,混养处于两者之间.3种生长方式获得的 蛋白核小球藻细胞碳水化合物和粗灰分的含量差 异并不大.异养和混养藻细胞抗坏血酸含量较高, 自养细胞最低,只有混养细胞的51%.细胞叶绿 素含量以自养为最高,混养其次,异养最低. 3讨论 现在国内外小球藻生产中使用较多的是开放 式或封闭式池塘培养系统(即自养方式),这种培 养系统造价和运转费用较低,但最大的问题在于 细胞浓度太低(通常干重<1g/L),从而造成细胞 收获和后加工成本很高,而且还存在培养液容易 污染,培养条件不易控制,产品质量不稳定等缺 点.小球藻能够进行高细胞浓度异养培养,为扩大 其生产规模开辟了广阔的前景.异养培养的优点 在于:可以借用发酵企业现有的厂房和设备,扩展 了生产的通用性;不需要光照辅助设备,降低了成本;发酵罐,管道系统和培养基很容易灭菌,可以 有效防止污染;受环境因素影响的程度小,培养条 件容易控制;微生物发酵中的流加培养技术,连续 培养技术均可用于小球藻的异养培养,大大提高 产量. 不过,本项研究的结果表明,小球藻的异养生 长速度和细胞浓度均低于在光照和有机质同时存 在时的混养培养,并且其异养代访}产物同自养代 第5期桂林等:蛋白核小球藻不同培养方式的比较55 谢和混养代谢有很大差异.要解决这个问题,一般 认为可采取以下方式:(1)采用混养培养方式.但 那样需要在发酵罐中安装光照设备,投资和运转 费用将会大大增加,而且在设备 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 和制造上有 很大的困难.是否采用这种方式主要取决于产物 的价值和成本之间的比较.(2)采用两步法的培养 方式:第一步用异养培养系统获得高细胞浓度的 培养液,第二步将培养液曝露在光照条件下,完成 细胞的光合代谢过程.由于此时细胞密度很大,光 线穿透率很低,应将发酵罐与透明玻璃钢制成的 螺旋式盘管相连,构成封闭的培养体系.培养液在 透明管道和发酵罐之间循环,同时管道曝露于光 奠镬之中(自然光或人造光源)J,这样就可以提高 小球藻色素(叶绿素,叶黄素等)的含量,使最终产 品的颜色同在开放式池塘培养系统中获得的产品 颜色相近,在生产依赖于光照的产物时可考虑这 种方法. 参考文献: ,姜悦.微藻生物技术[M].北京:中国 [1]陈峰 轻工业出版社,1999.9. 刘学铭,梁世中.小球藻的保健和药理作用 [J].中草药,1999,(5):385—386. 刘学铭,梁世中.小球藻在食品工业中的应 用及小球藻食品的研制[J].武汉食品工业 学院,1999,(1):47,52. ShiXM,ChenF.Heterotrophicproductionof luteinbyselectedChlorellastrains【JJ.Jounral ofAppliedPhycology,1997,(9):445,450. 韩雅珊.食品化学实验指导[M].北京:北京 农业大学出版社,1992.4. 无锡轻工业学院,天津轻工业学院合编.食 品分析[M].北京:中国轻工业出版社, 1994. 袁建平,张义明.高效液相色谱法测定藻类 中的类胡萝卜素和叶绿素[J].色谱,1997, (2):133,135. 杨鹭生,李国平.蛋白核小球藻粉的蛋白质, 氨基酸含量及营养价值 评价 LEC评价法下载LEC评价法下载评价量规免费下载学院评价表文档下载学院评价表文档下载 [J].亚热带植 物科学,2003,32(1):36,38. 刘志伟,余若黔.微藻培养的先生物反应器 [J].现代化工,2000,20(12):56,58. COMPARISONOFTHEDIFFERENTCUIIVATIONSYSTEMS oRCHLoRELLAPYRENoIDosA GUILin,SHIXian.ming2, LILin,HUSong.qing,LIUGuo.qin (1.CollegeofLightIndustryandFoodTechnology,SouthChinaUnivenityofTechnology, Guangzhou510640,China;2.DepartmentofFoodScienceandTechnology, ShanghaiJiaotongUnh,ersity,Shanghai201101,China) Abstract:Chlorellapyrenoidosa15— 2070wascultivatedinthreeculturesystems,fromwhichthemaximalbiomass concentrations(dryweight)andthespecificgrowthrateswereobtained.ThechemicalcompositionsofC.pyrenoi- dosacellsfromthreeculturesystemsweredeterminedandtheirdifferenceswerecompared. Keywords:Chlorellapyrenoidosa;autotmphy;heterotrophy;mixotrophy ]J]J]J]J]J]J]J]J